在生物體中，細胞內的細胞間質及體液成分構成了細胞生存的微環境。穩定的微環境是保持細胞的正常增殖、分化、代謝以及其他功能活動最為重要的條件，細胞內或細胞間的信息傳遞也離不開其所處的環境。
此外，在一些疾病的治療中，藥物分子與病變組織分子間相互作用，也會改變其微環境，可通過研究細胞或組織的微環境來評價藥物治療效果。
因此，對細胞微環境的高解析度、高靈敏度探測成為了生物醫學的重要研究課題。
圖源：中科院長春光機所，Light學術出版中心，新媒體工作組
光學顯微技術可以將微米甚至納米量級的微小物質及結構展現在我們面前，是我們打開微觀世界大門，觀察細胞組織和生物微環境的鑰匙。
若成像基於螢光發光團的螢光強度進行數據分析，則可稱之為螢光強度顯微技術。此類顯微技術通過顯微鏡的目鏡收集樣品各個位置的螢光強度，便可以得到生物組織的形貌，具有較髙成像空間解析度，但受螢光團濃度的影響，其測量精度和定量分析能力都不理想。
幸運的是，在種類繁多的顯微技術中，螢光壽命顯微成像技術（FLIM）具有對生物大分子結構、動力學信息和分子環境等進行高分辨高精度測量的能力，因此其重要性日漸提升，被廣泛地應用於生物學研究及臨床診斷等領域。
近期，美國莫格裡奇研究所的Melissa C.Skala【⏬拓展連結】課題組在Journal of Biomedical Optics發表了題為「Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications」的綜述文章，詳細介紹了FLIM的發展，總結了時域、頻域兩類螢光壽命探測方案，考察了對細胞異質性測量的圖像算法，最後列舉了FLIM在生物醫學上的實際應用。文章證實了FLIM在細胞微環境觀測領域的適用性，可被應用於疾病控制和藥物療效的監測。
螢光壽命
分子包含多個能態S0、S1、S2和三重態T1，每個能態都包含多個精細的能級。正常情況下，大部分電子處在最低能態即基態S0的最低能級上，當分子被光束照射，會吸收光子能量，電子被激發到更高的能態S1或S2上，在S2能態上的電子只能存在很短暫的時間，便會通過內轉換過程躍遷到S1上，而S1能態上的電子亦會在極短時間內躍遷到S1的最低能級上，而這些電子會存在一段時間後通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態，這個過程會釋放一個光子，即螢光。
此外，亦會有電子躍遷至三重態T1上，再由T1躍遷至基態，但是該過程發生機率較螢光輻射機率而言可以被忽略。
螢光的特性包含有：螢光激發和發射光譜、螢光強度、量子效率、螢光壽命等,其中，螢光壽命是指螢光分子在激發態上存在的平均時間（納秒量級）。
圖1 螢光分子能級結構及躍遷示意圖
圖源：J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020). Fig.1
FLIM測量方案
分子的螢光壽命在幾納秒至幾百納秒之間，因此，測量螢光壽命需要極快響應時間的探測器。如今主要存在兩類方案：一是時域測量，由一束窄脈衝將螢光分子激發至較高能態S1，接著測量螢光的發射機率隨時間的變化（圖2a,b）。典型的時域測量方法有TCSPC和時間門（TG）兩種。TCSPC利用快速秒表測量激發脈衝與探測螢光之間的時間差。使用高重複脈衝激發光激發樣品，在每一個脈衝周期內，最多激發螢光分子發出一個光子，然後記錄光子出現的時刻，並在該時刻記錄一個光子，再下一個脈衝周期內也是相同的情況，經過多次計數可以得到螢光光子隨時間的分布曲線。相似的，TG則探測不同時間窗口內的螢光強度，通過曲線擬合得到螢光壽命。二是頻域測量，對連續激發光進行振幅調製後，分子發出的螢光強度也會受到振幅調製，兩個調製信號之間存在與螢光壽命相關的相位差，因此可以測量該相位差計算螢光壽命（圖2c,d）。
圖2 時域和頻域的FLIM測量方案原理示意圖：a、TCSPC方案；b、螢光光子到達時間直方圖；c、頻域測量示意圖；d、不同螢光壽命下，相位與頻率的關係
圖源：J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020). Fig.4
各種FLIM測量方案的優缺點對比
兩類方法均存在各自的優缺點：
時域測量方法對於螢光強度較弱的樣品可以得到更好的時間解析度和更高的信噪比，並且測量方法更為簡單，易於掌握。
而當樣品螢光強度較高時，由於使用的電子器件處理速率限制，無法準確提取螢光壽命信息。
對於頻域測量法，採集速度快，可以測量短時間內的生物細胞運動情況，一般用於螢光強度足夠強的樣品中。
FLIM顯微裝置
目前為止，FLIM已被應用在兩種顯微技術的裝置結構上，分別為雷射掃描共聚焦顯微技術（LSM）和寬場照明顯微技術（WFM）（圖3）。
LSM採用雷射作為光源，成像過程需要對樣品進行掃描。其中，作者主要介紹了共聚焦螢光壽命顯微成像技術（CLSM-FLIM）和多光子螢光壽命顯微成像技術（MP-FLIM）。
CLSM-FLIM利用針孔濾去焦平面外的背景噪聲，接著通過振鏡對樣品進行二維平面上的掃描，配合目鏡對軸向的掃描，可以實現3D成像。
MP-FLIM則引入了多光子成像，以雙光子成像為例，若兩個光子能量值之和等於螢光分子基態S0與激發態S1的能級差，則螢光分子能同時吸收兩個光子，使電子被激發至S1能態，並發生輻射躍遷產生螢光。MP-FLIM由於需要使用低光子能量、長波段的光源，所以受散射影響更小，多被用於大腦等深度成像領域。
總的來說，LSM具光學層析能力，並且有更高的信噪比和空間解析度。
與LSM不同，WFM採用平行光照明樣品，物鏡收集整個視場內樣品發出的螢光並利用相機記錄。WFM-FLIM具有更快的成像速度，更小的光損傷，但是由於每個像素值均受其他像素位置的散射光影響，所以信噪比不如LSM。現今，TCSPC、TG等時域螢光壽命檢測技術和頻域解調螢光壽命的技術均已被成功應用於WFM，實現快速生物組織的成像。
圖3 LSM-FLIM與WFM-FFLIM結構對比示意圖
圖源：J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020). Fig.5
FLIM生物醫學應用
FLIM在生物學上的應用根據螢光分子種類可以分為三種：分別為自發螢光FLIM、外源分子探針FLIM和FRET-FLIM。
自發螢光FLIM被廣泛應用於非標記生物成像領域。所謂自發螢光，即生物細胞本身便包含螢光分子，稱為內源性螢光分子團。FLIM通過對自發螢光分子團（如NAD(P)H和FAD）螢光壽命的考察，可以實現細胞代謝的監測（圖4(a)）。這種方案無需人為對樣品加入螢光試劑便可以發射螢光，有效減少了螢光染料對樣品的毒性、螢光分子與樣品的非特異性結合及染料對生理性能的幹擾影響。
外源分子探針FLIM藉助於外部螢光染料的注入以產生螢光（圖4(b)）。如今，為了利用FLIM對物理條件（包括粘度、溫度、酸度和氧化作用）的敏感性，已經開發出了許多適用於體內和體外應用的光學探針。
圖4 FLIM生物成像結果：a、小鼠乳腺腫瘤的NAD(P)H螢光壽命成像結果；b、小鼠的紅外螢光壽命成像結果
圖源：J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020). Fig9-10
FRET-FLIM，當生物供體螢光分子與受體相互作用時，會產生螢光能量共振轉移（FRET），供體螢光淬滅，導致壽命減少（圖5）。FRET已用於探測蛋白質中的構象變化，蛋白質之間的受體/配體相互作用、核酸鏈的雜交或分裂、膜脂質相互作用和分布、蛋白酶的活性、染色質結構和許多其他現象。因此，藉助於FRET，FLIM可更好地捕獲細胞外和亞細胞相互作用。
圖5 FRET-FLIM原理示意圖：a、供體受體相距較遠，無螢光淬滅；b、供體與受體相互靠近，發生螢光淬滅；c、受體的光漂白可以確認供體螢光壽命的變化是由於FRET相互作用引起的
圖源：J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020). Fig.2
FLIM優勢
作者主要分析了FLIM相比於螢光強度成像的優勢。通過螢光強度成像可以獲得螢光分子的空間分布，較為直接和簡便，但是當螢光分子具有相似的頻譜特性，或是同樣的螢光分子在不同環境下時，依賴強度進行成像的方案便無法準確反映信息。
與基於光強的成像方式不同，FLIM成像適用於測量螢光分子環境的變化，或是測量分子的運動情況（圖6）。其結果與螢光分子濃度無關，且不受影響光強的光散射或是光吸收影響，可以精確測量螢光淬滅過程，對生物分子微環境進行定量測量。
圖6 螢光強度成像與螢光壽命成像對比
圖源：Principles of Fluorescence Spectroscopy Chapter 22 Fig.22.1
FLIM技術與挑戰
在裝置上，FLIM搭建成本更高，並且為了準確地擬合螢光壽命，需要探測更多地光子，尤其是採用時域方案測量壽命時,採集速度較慢，限制了FLIM在快速生物成像中的應用。
在數據處理上，由於曲線擬合迭代過程的需求，計算成本較其他成像方案更高。
在成像原理上，螢光壽命受多種外界因素影響，這些因素包括分子相互作用、pH值、溫度和粘滯阻力等，很難對這些參數控制變量，使得測量螢光壽命存在交叉幹擾問題。此外，與普通光學顯微技術類似，介質光散射影響成像信噪比及空間解析度，成像深度受到限制。
特別地，對於內源性螢光分子，螢光量子效率較傳統染料低幾個數量級，使得自發螢光FLIM的發展受到限制，此外，當螢光壽命接近時，很難將多種內源性螢光分子區分。因此，實驗中需要保持樣本之間參數的一致性，並需要對每天的對照樣本進行成像。此外，可以利用藥物直接調節自發螢光分子的含量，例如已有研究表明杜醌可以調節NAD +與NADH的比例。
總結與展望
如今，FLIM已經在系統裝置、螢光探針和數據處理算法等方面得到了較快的發展，這也使得FLIM在對細胞微環境成像和生物代謝監測發揮出不可替代的作用。
結合多種先進成像系統，如雙光子成像、結構光照明等，可進一步提升FLIM的解析度和測量精度。
另一方面，提升螢光壽命解調的算法性能，將壓縮感知、深度學習等熱點算法與FLIM結合，也同樣對FLIM的發展起著至關重要的作用。
總的來說，FLIM的發展很好地彌補了基於強度成像的問題，對生物醫學檢測有著重要的意義。
文章信息
J. of Biomedical Optics, 25(7), 071203 (2020).