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所有的孩子都生活在同一片天空下，但不是所有的孩子臉上都洋溢著天真的笑容。有這麼一群特殊的孩子，他們不聾，卻對聲音充耳不聞；他們不盲，卻對周圍人與物視而不見；他們不啞，卻不知該如何開口說話。
他們，被稱為「來自星星的孩子」。
兒童自閉症，是一類以嚴重孤獨、缺乏情感反應、語言發育障礙、刻板重複動作等為特徵的發育障礙疾病。患有自閉症的孩子在外表上與常人一般無二，但卻像隔了一堵無形的牆，使人無法觸及他們的內心。
更令人遺憾的是，目前治療自閉症的方法十分有限，早發現、早治療、早幹預已經是當下較有效的治療措施。
2020年11月27日，張鋒、Paola Arlotta和Aviv Regev領導的研究團隊在Science上發表了題為：《In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes》的研究論文。
此項研究應用CRISPR基因編輯技術和單細胞測序技術的組合系統——Perturb-Seq，成功在多個小鼠胚胎中敲除35個自閉症譜系障礙(ASDs)候選基因。這種方法可以識別神經元和神經膠質細胞中的基因表達網絡，以此揭示ASD相關基因的新功能。
CRISPR-Cas技術與單細胞RNA測序的聯合
組織是複雜多樣的，包含多種細胞類型。細胞內有成千上萬的基因與人類疾病相關，而這些基因的破壞可能會影響組織中任何一個甚至所有的細胞。因此，即使CRISPR基因編輯技術已經十分發達，但想要研究哺乳動物組織中所有細胞類型的基因敲除影響仍是十分困難的事情。
Perturb-Seq通過與ASD/ND相關的危險基因的微擾確定了神經元和神經膠質相關的效應
單細胞RNA測序和CRISPR-Cas技術的結合為研究人員提供了新的思路，這一組合系統可以生成豐富的細胞信息描述（如轉錄組），同時引入和評估遺傳擾動的影響。因為每個細胞都是獨立測序的，所以可以創建具有不同遺傳操作的嵌合組織，並在一次實驗中評估多種基因對細胞類型和狀態的影響。
Perturb-Seq對ASD/ND候選基因進行功能評估
在此項研究中，研究團隊應用一種可擴展的遺傳篩選方法——Perturb-Seq，實現對35個自閉症譜系障礙/神經發育遲緩(ASD/ND)候選基因進行功能評估。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術，研究人員在小鼠胚胎的大腦中引入這些風險基因的移碼突變，然後對出生後小鼠的大腦中受幹擾的細胞進行單細胞RNA測序。
體內Perturb-Seq平臺的模式圖
研究人員發現，在這35個ASD和ND相關基因中，有14個具有可檢測的效果。這些數據強調了ASD和ND病理的複雜性，因為神經膠質細胞和神經元細胞都顯示了紊亂的表達網絡。
為了確定在小鼠大腦皮層中發現的擾動相關基因模塊是否與ASD/ND病理相關，研究人員對ASD和控制人類大腦的數據進行了共分析。結果表明在小鼠Perturb-Seq分析中確定的幾個基因在人類腦組織中都是保守的。與ASD患者的單細胞數據比較顯示，兩者在受影響的細胞類型和轉錄組表型上都有重疊。
Perturb-Seq檢測ASD/ND風險基因的細胞型分析
例如，染色質域解旋酶DNA結合蛋白8(Chd8)的幹擾影響膠質細胞的表達模式，包括少突膠質細胞和星形膠質細胞。Chd8在小鼠皮層的興奮性神經元中高度表達，先前的研究表明，Chd8的單倍體功能不全會影響皮層和紋狀體中神經元網絡的發育。
在Chd8+/ 小鼠模型中驗證少突膠質細胞的擾動作用
但值得注意的是，本研究表明Chd8擾動對興奮性神經元無顯著影響。由此可見，複雜的神經元和神經膠質相互作用可能導致與ASD和ND相關的多種多樣的病理變化，並且可能在每個大腦區域都有特定的作用。
Perturb-Seq也不可避免地具有一定的局限性
整體來說，這項研究是成功的，這也使得我們對受特定自閉症譜系障礙風險相關基因影響的細胞類型有了更多的了解。然而，Perturb-Seq分析也具有一定的局限性。
例如，使用Perturb-Seq，很難確定該基因是否與某個病例有關。此外，與經典的體內遺傳篩選相比，Perturb-Seq的基因缺失的表型效應並不明顯。更重要的是，單細胞基因組擾動測序需要層層過濾、計算分析和統計測試來評估表型效應。並且當對於任何給定的幹擾每個細胞類型的數量很少時，基因缺失細胞和正常細胞之間的簡單差異表達分析是不能被執行的。
體內Perturb-Seq揭示了ASD/ND風險基因微擾的細胞類型特異性效應
除此之外，相對於接受對照組的細胞，微擾效應大小是根據不同細胞類型的相關表達模塊計算的。數據稀疏、批次之間的技術差異、遺傳消融狀態的不確定性和某些細胞類型的低細胞數量，使得使用單細胞RNA測序數據很難正確評估擾動相關表型。
在本研究中，作者通過在單基因缺失的小鼠以及自閉症患者的腦組織中進行後續實驗，驗證了某些關鍵關聯。數據指向了患有ASD/ND的人類和小鼠的一組基因，這些基因一直處於失調狀態。
總而言之，此項研究表明結合CRISPR基因編輯技術和單細胞RNA測序技術開發的Perturb-Seq，是一種十分強大且應用靈活性好的新工具。它可以實現對一系列基因的功能評估測定，揭示這些基因在複雜組織中、單細胞分辨時的細胞內在功能。正如在這項研究中，研究團隊演示了Perturb-Seq在小鼠發育中的大腦中的ASD/ND風險基因的應用。
值得一提的是，科學技術的發展使得科學家能夠不斷開發新的方法去做出更有創造性的研究。了解和開發ASD乃至所有其他人類疾病的治療方法是迫切需要的，而如今，Perturb-Seq技術為我們打開了一扇全新的大門！
參考文獻：
[1] Jin, Xin et al. 「In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes.」 Science (New York, N.Y.) vol. 370,6520 (2020): eaaz6063. doi:10.1126/science.aaz6063
[2] Treutlein, Barbara, and J Gray Camp. 「Sequencing perturbed cortex development.」 Science (New York, N.Y.) vol. 370,6520 (2020): 1038-1039. doi:10.1126/science.abf3661