重審CRISPR的脫靶效應,Nature Methods發文全面分析基因編輯鼠的脫靶位點

2021-02-23 生物醫學科研之家

撰文/責編丨迦  漵

2017年5月30日，Nature Methods雜誌發表的來自美國哥倫比亞大學醫學中心（Columbia University Medical Center）的一篇題為「Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo」的文章，研究人員在確認了兩隻小鼠體內已經用CRISPR技術成功修復了導致小鼠失明的基因之後，通過全基因組測序後發現小鼠體內有超過1500個單核苷酸發生突變，並且有100個以上的位點發生發生了大片段的缺失和插入，文章的主要結論是「CRISPR-Cas9技術可引發基因組上發生數百個意想不到的的基因突變」（【聚焦】CRISPR可致數百個位點突變，引入基因治療需謹慎），論文在線之後頓時引起軒然大波，甚至影響到了基因編輯公司的股價。

然而上述文章在線整整一年後便遭遇撤稿。論文被撤稿的同時，Nature Methods還刊出了一篇題為 CRISPR off-targets: a reassessment 的社論，描述了整個事件的過程，並且表明了編輯部的態度。值得玩味的是，編輯部說這篇論文是經過同行評審過的，但是很遺憾他們邀請的論文評審專家沒有一位對小鼠的遺傳背景方面較熟悉（爭議熱門論文遭撤稿丨特別關注）。

然而有關CRISPR-Cas9基因編輯的脫靶效應的評估仍然沒有得到很好的解決，過去只是在細胞系水平進行的分析，然而特別是經過基因編輯改造後的模式動物小鼠和大鼠體內尚缺乏系統的脫靶效應分析。

近日，Genentech公司的研究團隊在Nature Methods雜誌上發表了題為「CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice」的文章，詳細分析了81組基因編輯的小鼠和大鼠身上1423個預測的脫靶位點，通過深度測序確認了其中的32個。而在使用單個sgRNA（Pnpla3 sgRNA）處理的10個小鼠胚胎的全基因組測序數據分析發現了43個脫靶位點。

使用單個Pnpla3 sgRNA分析得出的43個脫靶位點也許是比較糟糕的一種情形，而如果使用打分更高的sgRNA或提高Cas9的保真度，那麼應該能夠降低基因編輯帶來的脫靶風險。

上述結論也再一次駁斥了此前被撤稿論文聲稱的「CRISPR-Cas9技術可引發基因組上發生數百個意想不到的的基因突變」，然而脫靶效應仍然不容忽視，畢竟單個sgRNA還是可以產生數十個脫靶位點。

參考文獻：

1、Schaefer, K. A., Wu, W. H., Colgan, D. F., Tsang, S. H., Bassuk, A. G., & Mahajan, V. B. (2017). Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nature methods, 14(6), 547-548.

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      2，ps330S-2-cas9-sgRNA（可用於同時敲除2個靶點的載體）
      3，p-p53-cas9-GFP （可用於小鼠p53基因敲除的載體）

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CRISPR/Cas9技術培訓背景介紹：

CRISPR/Cas9 是細菌和古細菌在長期選擇壓力中形成的一種適應性免疫防禦，可用來有效抵禦病毒及外源DNA的入侵。CRISPR的Type II已經被廣泛用於基因工程，它包含Cas9，crRNA和tracrRNA，其中crRNA含有能夠識別20bp的靶向互補序列。Cas9，crRNA和tracrRNA組成複合體，識別並結合crRNA互補的序列，然後解開DNA雙鏈，Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈，RuvC活性位點剪切非互補鏈，最終導致DNA的雙鏈斷裂（DSB），進而實現基因的敲除和插入。

目前，CRISPR/Cas9系統已經廣泛用於對哺乳動物細胞，細菌，斑馬魚，小鼠，豬，猴的基因編輯。本學習班將詳細講解CRISPR/Cas9基因編輯工具原理，操作流程，理論結合實踐，將讓大家詳細了解到具體如何利用CRISPR/Cas9技術構建基因修飾動物等。學習班將為相關科研工作人員和興趣愛好者提供了很好的培訓資源。 

 

講師介紹：這次學習班我們邀請了兩位在基因編輯領域具有豐富實操經驗的教授作為主講人，通過三天的系統學習，能讓您熟悉並掌握基因編輯技術的核心知識點與詳細操作技巧。



第一天與第二天主講人：李博士


德國慕尼黑工業大學海歸博士，具有多年豐富的基因編輯實操經驗

參與德意志研究基金委項目(DFG)用於人類癌症研究的轉基因克隆豬模型 (SCHN971/3-1)

Ø博士導師為原英國Roslin Institute克隆羊「多莉」團隊的Prof. Dr. Angelika Schnieke

Ø成功構建世界上第一頭ROSA26雙螢光豬模型，極具有生物醫學價值(已發表)。隨後，成功構建Kras點突變基因修飾克隆豬模型，該模型為構建胰腺癌大動物模型提供了有力工具，為胰腺癌相關靶向藥物開發，尋找新的胰腺癌治療手段等提供了新的動物模型。


第三天主講人：王永明教授

研究員，博士生導師，2015年國家青年千人獲得者。1997-2001年就讀蘭州大學生命科學學院並獲得學士學位，2001-2004年就讀東北師範大學生命科學學院並獲得碩士學位，2005-2010年在德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心（MDC）做博士生研究，並獲得柏林自由大學博士學位。2010-2013年在史丹福大學醫學院從事博士後研究。2013年至今歷任復旦大學生命科學學院青年研究員、研究員。 

王永明博士於2010年在史丹福大學醫學院做博士後研究，較早的開展了對基因編輯技術的研究和應用，主要貢獻有1）首次把基因編輯技術用到了心血管領域，論文發表在Circulation Research上，被評為2012年度心臟領域最好的論文；2）首次用基因編輯技術製作了長QT綜合症幹細胞模型；3）發明了附著體CRISPR/Cas9技術，可以高效的敲除基因；4）發明了高通量測試gRNA效率的方法，篩選了5萬多個gRNA的活性。

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    近期發表在 Nature 雜誌上的一篇研究報導顯示，單鹼基基因編輯存在脫靶效應，會導致 RNA 突變。這顛覆了科學界原來的認識，即單鹼基基因編輯的編輯效果更為精準，在應用過程中也更為安全。但是，隨著研究的深入，研究人員發現 CRISPR-Cas9 存在脫靶風險，即在導入 CRISPR-Cas9 後會導致非目標區基因的改變，由於這一技術是直接修改生物基因組，因此其具有難以消除的遺傳效應，脫靶效應存在潛在的巨大害處。
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    CRISPR-Cas9是一種在細菌中首次發現的酶，可以經編程後在精確的基因組位點上切割和修復DNA，因而被稱為「分子剪刀」。它可用於校正存在缺陷的DNA鏈，而且目前正在臨床試驗中測試它抗擊癌症、血液疾病和遺傳性失明的效果。這種技術被認為具有治療數千種人類遺傳疾病的潛力。
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    完成單位：中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心/神經科學研究所 　　CRISPR/Cas9及其衍生工具是廣泛應用的新一代基因編輯工具。然而，其脫靶風險一直備受關注，也是阻礙該技術應用於臨床的主要瓶頸之一。
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    中國科學家發現基因編輯RNA脫靶問題並進行優化 2019-06-11RNA脫靶問題並進行優化　中國科學院科技攝影聯盟 謝震霖　攝 　　中新網上海6月11日電 (鄭瑩瑩)據中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心11日發布的消息，中國科學家最新發現了基因編輯RNA脫靶問題並進行優化，相關研究論文於北京時間6月10日深夜在線發表在國際學術期刊《自然》上。
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    2018年11月，輝大基因在成立初期完成了夏爾巴投資的3000萬元人民幣的天使輪融資。輝大基因是一家基於基因治療藥物研發的轉化型生物科技企業，主要做人類罕見遺傳疾病及其他疑難疾病的新型治療技術及藥物的研究與開發。
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    且質粒不斷產生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉染RNP蛋白複合體的方法，通過優化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎上，提高轉染效率、減少細胞毒性、降低脫靶，進而提高了基因編輯效率。
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    然後，藉助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進行鹼基配對，這種嵌合RNA能夠引導Cas蛋白複合物結合到這個位點上並進行切割，因而這種嵌合RNA也稱作嚮導RNA(sgRNA)。目前已在細菌中發現三類CRISPR/Cas系統，I型和III型系統需要眾多蛋白的參與，因而不適宜操作和改造。
  • (從分子生物學視角看CRISPR-Cas9技術敲除人CCR5基因)
    讓我們不妨講的更專業一些：每當細菌感染了新的噬菌體，CRISPR序列（磚頭）便會捕獲游離在胞漿中的噬菌體DNA片段（橡皮筋）並整合在其間，由此便形成了由噬菌體DNA片段（單鏈）和短回文DNA序列（雙鏈）交替出現的完整CRISPR位點。       那麼細菌用小本本把噬菌體的DNA片段記下來之後，還是沒消氣怎麼辦呢？
  • 遺傳學大牛Nature Methods發布CRISPR重要成果
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