在神經發育過程中，神經前體細胞通過細胞增殖和分化形成神經元，進而形成皮層的六層結構。錐體神經元大部分由放射狀神經膠質細胞（RGC）分化而來，而後者是高度極化的細胞，以區間動態核遷移（INM）為特徵，即細胞核隨細胞周期改變而沿頂-基軸規律移動。在細胞周期的G1期，細胞核從室面向頂端移動，在S期位於皮層基底端，在G2期返回室面，並在此處進行細胞分裂。
控制INM的分子機制涉及肌動蛋白和微管系統，前者通常與細胞核從室面向頂端遷移有關，而後者通常與細胞核從基底端向室面遷移有關。大量證據表明，中心體在細胞核從基底端向頂端遷移過程中至關重要，它組織了微管的形成。Cep120和TACC是微管中的兩種蛋白，它們在微管中參與連接中心體和細胞核，抑制這兩種蛋白的表達，可擾亂INM，並導致細胞分化減少增殖增加。儘管中心體蛋白在INM和維持細胞池中非常重要，但其具體機制尚不清楚。
皮層western blot結果表明，DOCK7在胚胎第11天開始表達，並且持續到至少出生後第3天，這表明DOCK7在皮質神經發生的活躍期表達（圖1a）。免疫組化結果顯示E13.5時Tuj1+的神經元及Nestin+的VZ區前體細胞中高表達DOCK7（圖1b），提示DOCK7表達的與神經發生密切相關。
值得注意的是，DOCK7在VZ區高表達於室管膜面，該部位Nestin陽性的前體細胞中，DOCK7與中心體標誌物γ-tubulin共標，表明DOCK7存在於中心體（圖1c），體外研究也證實了這一點（圖1d）。這些數據證實了在皮質前體細胞中心體中表達DOCK7。
2、出生前抑制DOCK7表達促進VZ區前體細胞增殖
Dock7＃2或scr＃1 shRNA（對照組）構建體以及EGFP-NLS質粒一起通過胚胎電轉導入E13.5小鼠大腦，並在E15天進行BrdU染色，注射2小時後進行免疫螢光分析（圖2）。Dock7＃2 shRNA組VZ區BrdU+前體細胞的百分比顯著高於scr＃1 shRNA組（圖2a，b）。通過導入DOCK7的cDNA可顯著逆轉VZ區BrdU+前體細胞的增加（圖2a，b）。
該研究進一步通過免疫螢光染色磷酸化的組蛋白H3（PH3）（一種有絲分裂標記），研究VZ區細胞有絲分裂水平（細胞中轉染PH3陽性的百分比）。Dock7＃2 shRNA組的有絲分裂水平明顯高於對照組和逆轉組（圖2c，d）。因此，敲除DOCK7表達顯著促進了VZ區神經前體細胞的增殖。當過表達DOCK7時，可觀察到相反的結果（圖2e–h）。
為了進一步了解DOCK7表達的改變如何影響神經前體細胞的增殖，在E13.5天進行胚胎電轉，2天後對注射BrdU。對進入細胞周期（BrdU + Ki67 +）或退出細胞周期（BrdU + Ki67−）的細胞進行定量（圖2i–n）。在Dock7敲除組中BrdU和Ki67雙陽性細胞的百分比升高（圖2i，j），在DOCK7過表達組中的比例降低（圖2l，m）。相反，BrdU+Ki67-細胞的百分比在敲除組降低（圖2i，k），在過表達組升高（圖2l，n）。這些數據表明DOCK7敲除促使細胞進入細胞周期，而DOCK7過表達則促進退出細胞周期。
根據上述研究結果，DOCK7可能影響RGC從增殖向分化和神經發生的轉換。為了證實這一點，在E13.5天胚胎電轉DOCK7敲除或過表達的質粒，用Pax6標記RGC，用Tbr2標記VZ基底面的前體細胞。與對照組相比，DOCK7敲除組Pax6+細胞增多而Tbr2+細胞減少（圖3a–d）。與之相反，DOCK7過表達可導致Pax6+細胞減少而Tbr2+細胞增多（圖3e–h）。因此，抑制DOCK7表達增加RGC細胞池內細胞的數量，而DOCK過表達則減少細胞池數量，並促進RGC分化為基底前體細胞。
E15.5天新生成的神經元通過中間區遷移至皮質板層，而保留自我更新能力的RGC則留在VZ區。與對照組相比，DOCK敲除組的細胞更多分布在VZ區，而在皮質板層和中間區分布較少（圖3i，j）。此外還觀察到DOCK7敲除組在基底前體細胞分布的SVZ區分布顯著減少。此外，Dock7敲除組中，Tuj1陽性細胞的百分比顯著降低（圖3k）。
當研究DOCK7過表達對神經發生的影響時，本研究觀察到VZ區轉染細胞的百分比減少，SVZ和中間區域細胞數量增加，但皮質板層的轉染細胞數量減少（圖3l，m）。DOCK7表達後，Tuj1陽性轉染的細胞數量顯著增加（圖3n）；然而，這些細胞大多數位於中間區，而在皮質板層中細胞數量相對較少（圖3l，m）。值得注意的是，這些位於中間區的大部分細胞都表現出多極性。DOCK7過表達促進了神經元的形成，該神經元能夠到達中間區，但向皮板層遷移時存在缺陷或延遲，這可能是由於神經元從多極性向雙極性轉變的過程存在缺陷所致。因此，除了控制神經元的發生，DOCK7還可能影響中間區神經元的極化和/或遷移。
影響RGC增殖的因素包括細胞周期時間、細胞極性和不對稱分裂，以及最新發現的INM。改變DOCK7的表達水平不會影響細胞周期的時間。然而，在BrdU標記實驗中發現，DOCK7敲除組和DOCK7過表達組BrdU標記的細胞核的位置有所不同，提示DOCK7可能影響INM（圖2a，e） 。與對照組相比，Dock7敲除組BrdU陽性細胞核的分布更靠近管室面，而在DOCK7過表達組中，細胞核位於VZ區更靠近基底端的位置。為了進一步確定DOCK7是否以及如何影響INM，在E13.5天胚胎電轉，2天後注射BrdU，在BrdU注射後15分鐘，2小時，4小時和6小時確定轉染細胞BrdU標記的細胞核位置（圖4）。
在BrdU注射後15分鐘，對照組、敲除組及過表達組中，VZ區大多數BrdU標記的細胞核都位於VZ區的上半部分，這與RGC細胞核在S期的已知位置一致（圖4a，b）。在對照組中，細胞核在注射後2小時內向室管膜區遷移，並在接下來的4小時繼續向室管膜區遷移（圖4a，b），與既往研究中S期向G2期轉化過程的細胞核遷移方向一致。在細胞核到達室管膜區表面後，RGC進行有絲分裂（距室管膜表面<20um）（圖4c，d）。DOCK7敲除加速了細胞核從基底端向室管膜端遷移（圖4a）。在注射後2小時，對照組僅一小部分細胞核到達室管膜面，而DOCK敲除組的細胞核的已有很大一部分已經到達該位置（圖4a），並在之後的4小時繼續存在於該位置，進行有絲分裂（圖4c）。實際上，在注射BrdU後6小時而非2小時，在DOCK7敲除組的VZ區中觀察到的更多BrdU + PH3 + 細胞圖4c）。相反，在檢測DOCK7過表達組的VZ區細胞的細胞核位置時，BrdU標記的核從基底端向室管膜面遷移的過程被延遲，在注射後6小時，許多細胞核仍保留在VZ區的上半部分（圖4b）。與對照組相比，在DOCK7過表達組中，BrdU + PH3 +細胞在基底端（距室管膜表面> 20 µm）的百分比較高，這表明細胞核向頂端遷移的延遲與細胞遠離頂端有絲分裂有關（圖4d）。
為了進一步證實上述發現，該研究在胚胎電轉後兩天進行時差顯微成像（圖5）。並用胚胎電轉技術標記細胞質和細胞膜。切片後進行時差顯微成像8至10小時。在對照組中，細胞核穩定地從基底端向室管膜遷移，並在室管膜進行有絲分裂（圖5a，e）。而大部分DOCK7過表達細胞的細胞核滯留在基底端，並且細胞遠離頂端的位置進行有絲分裂（圖5b，e）。這些發現證實了DOCK7敲除會加速細胞核從基底端向頂端遷移的過程，從而導致細胞核在頂端的時間延長，並導致頂端有絲分裂。綜合以上結果，可以得出結論，DOCK7嚴格調節了細胞核從基底端向頂端遷移的過程。
以三個不同的DOCK7片段作為引物（圖6a）使用雙雜交法在胎鼠大腦cDNA庫中進行篩查。其中一個片段，DOCK7 506–1164（DOCK7-R2），包含兩個陽性克隆，其中一個為與編碼Tacc3序列匹配的cDNA，而另一個為包含編碼Tacc3全長的cDNA。TACC3是TACC家族的成員，是與中心體和微管相關的蛋白質，與中心體引導的微管形成及核遷移有關，值得注意的是，它還與小鼠皮層發育過程中維持神經前體細胞細胞池數量相關。
使用過表達DOCK7和EGFP-TACC3的人胚胎腎細胞系（HEK293）的裂解物，通過共免疫沉澱實驗確認了兩者的相互作用（圖6b）。GST-TACC3融合蛋白可有效地抑制DOCK7的表達（圖6d）。在人SK-N-BE神經母細胞瘤細胞中進行的免疫細胞化學研究表明，DOCK7和TACC3共定位，特別是在中心體位置（圖6e）。綜上，這兩種蛋白存在相互作用。為了進一步研究DOCK7中TACC3結構域的作用，合成了在R2片段缺失的突變體（圖6a），並測試了它們與TACC3是否能相互作用。DOCK7中R2片段缺失後，不結合TACC3（圖6f）。
6、DOCK7通過拮抗TACC3調控INM和神經發生
敲除TACC可以阻止細胞核從基底端遷移至室管膜面，減少增殖前體細胞的數量並增加神經元的生成，這與DOCK7敲除的作用相反。本研究第一次單獨敲除TACC3，結果顯示敲除TACC3會抑制細胞核從基底端向頂端遷移，降低BrdU+細胞及有絲分裂細胞百分比，並增加Tuj1 +細胞百分比（圖7a-e）。這些數據表明DOCK7和TACC3在皮質神經發生過程中具有相反的功能。
E13.5天胚胎電轉敲除DOCK7和/或TACC3的質粒，並在2 d後進行染色。單獨敲除DOCK7可導致在室管膜面有絲分裂分裂的細胞百分比更高，VZ區增殖細胞數量增加，神經元生成減少。但是，同時敲除DOCK7和TACC3可完全逆轉上述改變（圖7f–j）。而為TACC3結合點突變的DOCK7過表達無法逆轉DOCK7敲除所致的INM異常，VZ區增殖前體細胞數量增加和神經元生成減少（圖7k-o）。總之，這些數據表明DOCK7通過拮抗TACC3功能來調控INM和皮質神經發生。
TACC蛋白可通過調節與中心體和細胞核偶聯的中心體相關微管的生長和完整性來調控皮質神經前體細胞的INM。因此，本研究觀察DOCK7是否拮抗TACC3的微管生長促進功能。使用非洲綠猴腎成纖維細胞樣細胞系（COS7）進行研究，與TACC3的作用相反，過表達DOCK7減少了微管的體積，值得注意的是，同時過表達DOCK7和TACC3，可使微管的體積恢復至對照載組大小（圖8a，b）。為了確定這些操作是否影響微管成核，本研究使用諾考達唑（使微管解聚）處理COS7細胞，並使其在藥物洗脫後得以恢復。在洗脫後5分鐘，所有組中的大多數轉染細胞均顯示出清晰的微管結構，表明微管成核不受影響。但是，在洗脫後20分鐘，與對照組及共表達DOCK7和TACC3的細胞相比，過表達DOCK7和過TACC3的細胞分別顯示出較小和較大的微管，如圖8a所示。
在培養的皮質前體細胞中，敲除TACC3顯著降低了微管叉狀結構的大小，而敲除DOCK7則顯著增加了微管叉狀結構大小（圖8c，d）。值得注意的是，同時敲除TACC3與DOCK7使微管叉狀結構的大小恢復到對照組的大小（圖8c，d）。
RGC細胞核與中心體的距離受微管生長和完整性改變的影響。胚胎電轉後的腦切片用β-微管蛋白（中心體標記）染色，並用DAPI（核標記）復染。TACC3敲除的RGC中，細胞核與中心體的距離增加，與之相反，該距離在DOCK7敲除的RGC中顯著減小，並且可以通過同時敲除DOCK7和TACC3來逆轉。（圖8e，f）。
結合以上數據，這些發現表明，DOCK7拮抗TACC3的微管生長促進或微管穩定功能。值得注意的是，DOCK7的這種作用與其DHR2結構域無關，因為過表達DHR2結合點突變的DOCK7能夠逆轉敲除DOCK7引起的細胞核-中心體距離減少。
皮層的神經發生依賴於放射狀神經膠質細胞（RGC）增殖與分化保持平衡，但如何控制這種平衡的分子機制仍不清楚。本研究提示，DOCK180蛋白質家族的成員，DOCK7，調節RGC的增殖與分化。在小鼠胚胎RGC中，敲除DOCK7可抑制細胞分化，並促進細胞自我更新。與之相反，過表達DOCK7促進RGC分化為基底前體細胞和神經元。本研究進一步提出證據，證明DOCK7通過控制RGC的區間動態核遷移來影響神經發生。DOCK7通過拮抗中心體相關蛋白TACC3的微管生長促進功能發揮作用。因此，DOCK7與TACC3的相互作用，調控了皮層發育過程中的INM和RGC神經發生。
原始文獻：
Yang YT, Wang CL, Van Aelst L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 2012;15(9):1201-1210. doi:10.1038/nn.3171