「你們做不出來。」
當得知大洋彼岸的中國，有個名不見經傳的小團隊要嘗試鑑定朊病毒，美國酵母朊病毒鑑定的頂級專家蘭德爾·哈爾夫曼（Randal Halfmann）這樣評價。
然而，就在最近，2019年1月21日，這個團隊的研究成果：《一種病毒編碼的朊病毒》（A viral expression factor behaves as a prion）發表在《自然-通訊》雜誌上[1]。
這一研究，將朊病毒的發現歷程從動物、植物、真菌、細菌擴展到了最後一種生命形式——病毒。同時，可能為揭示病毒感染和阿爾茲海默症之間的必然聯繫帶來新的啟示。
這是中國第一個成功在朊病毒鑑定領域開拓疆土的團隊，它的成員總共只有三人：許曉東、陳紅英和南昊。
這項研究的發起者，許曉東副教授| 南昊
蛋白膠上的「異常信號」
時間回到2002年，許曉東剛從中科院微生物所來到英國雷丁大學，跟隨著名病毒學教授伊恩·瓊斯（Ian Jones）讀博士。當時他的課題是研究昆蟲杆狀病毒中幾種晚期表達因子。
那時候，蛋白的研究手段還沒有現在這麼豐富。為了研究這些晚期表達因子的功能特徵，許曉東開始嘗試分別在昆蟲細胞和大腸桿菌中，重組表達這些蛋白。而為了檢測蛋白表達蛋白是否成功、表達蛋白的產量多少，就需要用到一套電泳+免疫印跡檢測方法。
這個過程，就好像是讓細胞中所有的蛋白進行一場「遊泳比賽」。由於這些蛋白原本形狀不一、電荷各異，會影響到比賽結果。因此需要先加入特殊試劑煮沸樣品，剝奪其形狀，覆蓋其電荷，讓它們變成統一直徑、穿著「等身負電荷泳裝」的「圓棒」。這樣，它們在遊泳池——聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中的遊速，就只和各自體重（分子量大小）有關了。
蛋白質樣品在100℃用SDS處理後變為帶電荷的「圓棒」
電泳凝膠的設計可謂十分精妙，它分為上下兩層，通電後，上層的濃縮膠會讓排隊進場的蛋白隊員們「縱列變橫列」，匯集於泳道前站成一排做好準備。等進入下層的分離膠，就像聽到一聲哨響，不同分子量的蛋白開始各自發力向終點（電泳槽正極）遊動。
質量小的蛋白受到的阻力小，遊得快；質量大的蛋白受到的阻力大，遊得慢。「遊泳比賽」結束後，通過後續檢測，就可以大致得知某種特定的蛋白含量究竟有多少了。
蛋白電泳用到的凝膠（示意圖）| 繪製：Nekout
通常來講，前期處理蛋白用到的試劑（SDS和巰基乙醇）會拆開所有聚合的蛋白，濃縮膠中是不會再留有蛋白的。所以，大家一般都會直接把它切下來丟掉，只檢測分離膠的部分。
而彼時，剛到英國第一次接觸這個操作的許曉東，對這套流程顯然尚不熟悉，誤打誤撞將濃縮膠也一併做了檢測。檢測過程中，他意外地發現了一種奇怪的現象：他的樣品中，一個名為LEF-10的杆狀病毒晚期表達因子出現在了濃縮膠裡，並且信號非常強烈。
LEF-10出現在濃縮膠中（示意圖）| 繪製：Nekout
若將這一現象講給一位蛋白試驗高手，那麼多半他的第一反應是「樣品加的太多啦，蛋白變性不徹底」。還是新手的許曉東，也懷疑這是自己操作的bug。
為了解決這個問題，他不停調整試驗方法，奇怪的是，無論怎麼調整，LEF-10蛋白都雷打不動地「賴」在濃縮膠裡不走。這個現象引起了許曉東極大的好奇。
許曉東有個好習慣，但凡遇到不明白的事情，就立刻去查找資料，甚至窮盡文獻，直到獲得令他滿意的解答為止。但是這一回，他遍歷了圖書館的相關書籍和期刊文獻，卻沒有找到任何相關記錄。
他又將這一現象匯報給導師，嚮導師請教。但他的導師剛剛申請到HIV相關的課題，對他那塊「奇怪的濃縮膠」並不怎麼感冒。沒有導師的支持，這一發現就此被選擇性的「忽略」了。
不過，從那時起，濃縮膠裡的異常信號，就一直縈繞在許曉東心頭。
在黑暗中緩慢前行
2009年，許曉東和妻子陳紅英回到中國，他想找一個可以遠離城市的地方安靜做科研，於是選擇了去西北農林科技大學生命科學學院任教。
夫妻二人共同建立起實驗室，也逐漸展開新的課題研究。
最讓許曉東惦記的，仍然是濃縮膠裡的LEF-10。他一心想搞明白那個異常信號到底代表著什麼。從英國到中國，他幾乎逢人就問，不放過一絲線索。他帶過的歷屆學生，也都知道他的這個心結。
不論怎麼問，許曉東聽到的答覆始終是「沒見過」、「不知道」。而越是這樣，他做下去的決心就越堅定。
對於科研，許曉東一直堅信這樣一個理念：好的課題，不能僅僅著眼於局部，而是要立意高遠，必須有生物學上的普遍意義。
他隱約感覺到，這個異常信號的背後一定蘊藏著某些特別的含義。而他的目標，就是無論如何也要找到其中隱藏的秘密。
不過，由於沒有任何可借鑑的先例，許曉東在研究初期完全找不到頭緒。他帶著自己的學生在黑暗中探路，一條行不通，就換另一條，反反覆覆嘗試，斷斷續續摸索，進度異常緩慢。
經過很長一段時間的努力，許曉東總算收集到一些關於LEF-10的重要線索。
線索一：聚合體分子量大且不均一
純化後的LEF-10蛋白，會形成大分子聚合體。許曉東通過分子量排阻色譜（一種檢測物質分子質量的方法）發現，LEF-10形成的聚合體並不是「統一規格」的，而是分子量不均一的聚合體「集合」。
LEF-10聚合體分子量大且不均一（示意圖）| 繪製：Nekout
線索二：聚合體常帶有DNA
既然是聚合物，那麼就有必要搞清楚它是由什麼聚合在一起的：到底是單純的LEF-10蛋白？還是有其他的生物大分子參與？通過酚氯仿抽提，許曉東竟然從聚合體中獲得了DNA。
聚合體常帶有DNA（示意圖）| 繪製：Nekout
線索三：截短體27-78形成的聚合體分子量呈現嚴格的倍數關係
DNA結合特性使LEF-10的研究變得複雜。許曉東便嘗試將這個蛋白截短，去掉能與DNA結合的那些胺基酸，看它是否還能形成聚合體。測試過多種類型的截短體後，他們發現當保留第27位到第78位胺基酸的部分時，該蛋白不再帶有DNA，但不影響聚合能力。更重要的是，這些聚合體按分子量呈現出了漂亮的倍數梯度。
截短體27-78形成的聚合體分子量呈現嚴格的倍數關係| 繪製：Nekout
線索四：LEF-10僅在少量細胞中表現為聚合體形式
後來，許曉東又將綠色螢光蛋白融合在了LEF-10蛋白上，觀察LEF-10在原生細胞中到底是什麼樣子。他發現，LEF-10在極少量的細胞中能形成有較強螢光信號的斑點。而大部分的細胞中LEF-10都是均勻分布在細胞中的。
LEF-10聚合體僅在少量細胞中出現| 參考文獻[1]
這些線索的碎片拼接在一起，讓黑暗中主人公的影子漸漸顯露出身形。它們在許曉東腦海中拼出了一個單詞——prion（朊病毒）。
被朊病毒感染的組織切片觀察| Wikimedia Commons
「朊病毒」這個概念對於大部人來說，多少有些陌生。它名叫病毒卻不是病毒，而是一類出了bug（錯誤摺疊）的蛋白質。朊病毒具有感染性，有時會造成致命的疾病。眾所周知的狂牛症、阿爾茲海默症，都與這類蛋白有密不可分的關係。
阿爾茲海默症與這類蛋白有密不可分的關係| 圖蟲創意
這些出錯的蛋白往往具有特殊的結構，這種結構能讓它們在某些條件下相互吸引，肩並肩緊緊粘在一起，形成堅實的高分子聚合體。這樣的聚合體很難被蛋白酶水解，普遍能夠耐受高溫、輻射和普通的蛋白變性劑。
這也就解釋了文章開頭濃縮膠裡那個異常信號的成因——LEF-10和目前已知的大部分朊病毒形成的聚合體類似，具有抵抗SDS變性的特性。100℃的高溫和SDS的聯合處理，都沒有辦法將這種蛋白聚合體拆開，這樣「大塊頭」的蛋白聚合體自然會卡在濃縮膠中裡出不來。
另外，許曉東在LEF-10上發現的現象和朊病毒其他一些特徵也能夠對應上，比如：朊病毒聚合體大多都不均一，分子量會呈現為倍數關係；一般朊病毒的形成需要某些特定的因素，因此僅會在少數細胞中變成聚合體。
這麼一來，許曉東的研究前景變得豁然開朗。
當時，科學界僅在哺乳動物和真菌中發現過朊病毒，還沒有人報導過病毒中的朊病毒。
他在2013年底的組會上對已有的工作做了總結，並將下一階段的目標定為：證實LEF-10是朊病毒，為「朊病毒廣泛存在假說」提供更多實例。
論證之路上的一波三折
在探索科學問題的過程中，從「觀察現象」到「提出假設」只是邁出了關鍵的第一步。只有通過合適的方法證實和嚴謹的邏輯論證，從不同的角度拿到充足的證據，證明現象與原因間的「必然性」，才能得到科學界的廣泛認可。
即便有了研究方向，論證的過程往往也沒有那麼容易。
研究朊病毒，許曉東將面對重重困難：他的課題組既沒有這方面的研究經驗，也沒有合適的工具和技術體系。朊病毒研究對他們來說，幾乎是完全陌生的領域。
在沒有研究基礎的情況下開拓新領域，對他們這樣一個小課題組來說，無疑要承擔巨大的風險和挑戰。但是，迎接這樣的挑戰，在許曉東看來，正是他做科研的樂趣所在和動力之源。
之後的很長時間，許曉東開始拼命閱讀朊病毒的相關文獻。他梳理出朊病毒的4個核心特徵：
1、能以非朊病毒和朊病毒兩種穩定狀態存在；
2、其中一種狀態可以自發或受某種誘導轉變成另一種狀態；
3、在某種情況下，朊病毒狀態可以被「治癒」；
4、兩種狀態都可遺傳下去。
也就是說，LEF-10至少需要通過這4項考驗，才有可能拿到朊病毒的「身份證」。而要對它驗明正身，就必須有一套行之有效且能被同行認可的鑑定體系。
酵母系統壁壘
目前，在朊病毒領域，學術界認可的鑑定體系是由已故的著名生物學家蘇珊·林德奎斯特（Susan Lindquist, 1949-2016)建立的釀酒酵母Sup35p鑑定方法[2]。
蘇珊·林德奎斯特| Wikimedia Commons
對許曉東而言，通過這個鑑定體系證實LEF-10的朊病毒特性，是讓科學界承認LEF-10是朊病毒的必由之路。
他立刻給蘇珊院士的得意門生——酵母朊病毒鑑定的頂級專家蘭德爾·哈爾夫曼（文章開頭提到的那位）寫郵件尋求這套系統，哈爾夫曼同意了，並告知他們「這套系統很棘手（tricky），你們做不出來」，許曉東發了地址過去，但最後不知為何始終沒有收到回復。
幾經輾轉，直至2014年底，在妻子陳紅英的幫助下，許曉東終於從英國肯特大學酵母朊病毒科學家米克·圖特（Mick Tuite）那裡拿到了類似的系統。相較美國科學家的系統，圖特的系統能夠更加嚴謹地對朊病毒進行鑑定。
拿到了酵母系統，欣喜之餘，暗藏的挑戰接踵而至。
這套系統遠比許曉東想的複雜與艱難。一方面是系統自身非常複雜，需要深厚的遺傳學背景才能知曉其中的原理。另一方面，這類實驗操作對很多細節的要求異常嚴苛，最好有熟練掌握這一技術的人手把手教上好幾年，才能獲得所有要領，否則「照著說明書也做不出來」。
長久以來，這個領域的新發現幾乎都被幾個酵母領域的研究團隊「壟斷」。所以，哈爾夫曼說他們「做不出來」，其實也不是沒有道理。
畢竟，與哈佛大學、麻省理工學院的資深團隊相比，許曉東他們無論在試驗條件還是技術經驗上均存在不言而喻的天壤之別。
然而這些困難絲毫沒有動搖許曉東的決心。他找到了當時正在讀研二的碩士生，南昊。
南昊（圖左）與許曉東（圖右）| 南昊
南昊是個非常擅於思考的學生，他平時涉獵廣泛，對很多科學問題都有自己的獨特見解，也懂得該如何設計試驗。
一開始，南昊對這個課題沒什麼興趣，但沒過多久，他就被這個領域深深吸引，覺得「越做越有趣」。南昊漸漸意識到，這項研究一旦成功，將是一次能夠「更新教科書」的成果。
南昊全身心投入到研究中，夜以繼日地做實驗。
事實證明，「壁壘」是真實存在的。這套酵母系統非常頑劣，南昊每一步都嚴格按照論文裡提供的方法來做，但就是做不出結果，走了很多彎路。
他和許曉東反覆討論細節不斷改進方案。後來，隨著文獻的不斷積累和操作上的日臻成熟，桀驁難馴的酵母系統一點點低下了高傲的頭顱，漸漸發揮出了功效。鑑定路上的四道大門被一道道解鎖。
與時間賽跑
釀酒酵母中，存在一種天然的朊病毒Sup35p。正常情況下，這個蛋白的功能是讓翻譯過程在該停的地方停下來。但受到某些刺激時，Sup35p蛋白會表現出朊病毒特性，在細胞中變為聚集體，就會失去對翻譯過程的管控，出現許多過度翻譯延長的蛋白質，最終影響酵母的表型。
這樣的變化雖然會使一些正常的蛋白失去功能，但同時也會讓一些提前終止突變（翻譯一半就停了）的蛋白恢復功能。例如，在釀酒酵母LJ14菌株中，它的腺苷酸合成通路中的ade基因中間就含有一個由突變產生的提前終止密碼子。
在Sup35p正常發揮功能時，ade基因翻譯到一半就終止了，因此LJ14菌株沒辦法自己合成腺苷酸，只能在額外提供了腺苷酸的培養基上生存。同時，ade基因的失效，使得腺苷酸合成的前體物在細胞中積累。
非常有趣的是，這種前體物是一種紅色的色素分子，能讓酵母呈現為紅色。但當Sup35p轉變為朊病毒時，ade基因中的提前終止密碼就不起作用了，核糖體能夠通讀過去，形成有功能的Ade蛋白，酵母就會變為白色。
這樣一來，只要用其他的DNA序列替代Sup35p，不就可以通過顏色表型初步檢測那段序列是否可以編碼朊病毒了？
於是，許曉東和南昊將LEF-10蛋白上的具有朊病毒特徵的部分胺基酸替換在了酵母的Sup35p蛋白上。成功的觀察到了和野生Sup35p相似的效果。
1.培養基上既有紅色菌落又有少量白色菌落——說明LEF-10能以非朊病毒和朊病毒兩種穩定狀態存在；
2.挑選紅色的菌落中酵母傳代，能觀察到自發形成的新的白色菌落——說明其中一種狀態可以自發或受某種誘導轉變成另一種狀態；
3.抑制或敲除了能促進朊病毒聚集的分子伴侶HSP104之後，LEF-10也會從朊病毒態的白色菌落變為非朊病毒態的紅色菌落——證明在某種情況下，朊病毒狀態可以被「治癒」；
4.白色菌落傳代能產生白色菌落，紅色菌落傳代也能產生紅色菌落——證明兩種狀態都可遺傳下去。
利用酵母系統驗證病毒中的朊病毒| 參考文獻[1]
由此，LEF-10的朊病毒特性幾乎可以說是板上釘釘了。
除此之外，他們陸續從其他角度（如該杆狀病毒侵染的昆蟲細胞、SDD-AGE等）共同證實了LEF-10的朊病毒特性；並找到了對LEF-10形成聚集體關鍵的胺基酸殘基位點[1,3]。
LEF-10的蛋白結構預測| 參考文獻[1]
就在他們收集證據的過程中，2017年1月，《科學》雜誌上報導了第一個細菌中的朊病毒[4]，這讓許曉東團隊受到鼓舞也倍感壓力，他們必須和時間賽跑，不然很可能被其他人超越。
終於到了投稿的階段，可能由於他們研究的對象（昆蟲病毒）比較「冷門」，先後被幾家頂級期刊拒稿後，最終被《自然-通訊》正式接收。在朊病毒鑑定領域中，第一次出現中國團隊的身影。
團隊主要成員許曉東| 南昊
這項研究成果得到了酵母朊病毒領域元老米克·圖特的認可（就是前面說到的提供酵母系統的教授），也讓許曉東當年的導師瓊斯倍感意外，他沒想到自己的學生可以把杆狀病毒中的朊病毒做到這個程度。
啟示
你可能會問，病毒中發現了朊病毒，意味著什麼呢？
病毒作為最小的生命形式，一共也沒有多少基因，這個蛋白對杆狀病毒來說有意義嗎？
這裡就要回到第二條線索——LEF-10的聚合體上帶有DNA。這意味著，它很可能是一種轉錄因子，在昆蟲體內會控制一些基因的表達。
病毒感染宿主後會開始大量複製，當他們數量太多的時候，就會過度消耗宿主的資源，並威脅到宿主的生命。
如果宿主死亡，病毒也就無法存活。
據推測，LEF-10蛋白單體行使的本職工作是促進病毒複製，當感受到宿主資源不足時，這些單體就開始聚集。聚集後的LEF-10不能行使原有功能，從而扼制晚期基因的表達，限制病毒的複製，讓宿主有喘息之機，最終實現病毒和宿主間的平衡關係。
這種調控方式可以被看成是一種「剎車機制」（可以理解為「節育」）。這種機制有利於病毒在宿主體內更長久的持續複製，能夠讓宿主存活更久，將其帶到更遠的地方「繁衍生息」。
圖| 參考文獻[1]；漢化：Nekout
另一方面，在病毒中發現朊病毒，也為解釋許多朊病毒相關的疾病提供了一種新的可能。
比如，長久以來困擾著全世界科學家的阿爾茲海默症。
在這項研究之前，科學界就早已發現了一種朊病毒能使另外一種不同的蛋白轉化為新的朊病毒[5-7]。
例如，在人的神經細胞中澱粉樣蛋白Amyloid beta（Aβ）能引發Tau蛋白聚集成具有細胞毒性的富β-片層狀聚合體[8]。不僅人自身的內源蛋白可以誘發這一過程，一些來自於病原微生物的澱粉樣蛋白也有類似的能力[9]。
近年來，已經有很多研究發現病毒感染與阿茨海默症發病之間存在關聯[10-12]，但還說不清具體的關係是什麼。而這項研究就給了人們一個新的提示：如果某些人源病毒，如皰疹病毒，也編碼類似的蛋白，一旦它在某些情況下入侵人腦，並產生朊病毒，就有可能誘發阿爾茲海默症。
當然，這樣的假設還有待進一步驗證，但它為研究病毒感染與阿爾茲海默症發病之間的必然性，提供了一個新的方向。
從困境到曙光
心之所向，雖遠必達。
時至此刻，17年前那次「異常現象」埋下的小小種子，終於在幾位執著的科研人的悉心呵護下萌芽長大，為朊病毒在不同生命形式的發現史蓋上「收官之印」。
而這些年，他們付出了太多常人無法想像的艱辛。
由於研究方向過於生僻，許曉東常年申請不到課題，評不上職稱，至今仍是一位七級副教授。因為缺少經費，他也不具備招生資格，大部分實驗都由南昊一人完成，偶爾還需要親自上陣。截至文章接收時，許曉東的帳面經費已不足千元。
許曉東的妻子陳紅英教授一直很支持他的工作，不惜犧牲一些自己很喜歡的課題，給予許曉東各方面的支持與鼓勵。
南昊為了這個課題，畢業後放棄了考博和工作的機會，主動留在實驗室繼續做實驗，全年沒有休過假，甚至過年都不回家。沒有補助，就在實驗間隙出去打工賺錢。
多年的堅守與付出終於有了回報。許曉東在日誌中認認真真感謝了每一位給予過他幫助的人，並感慨的寫下這樣一句話：「我們終究是幸運的，終於活著看見了今天的朝霞。」
病毒中發現阮病毒的故事，講到這裡也接近尾聲。它源於不經意的好奇，陷於刨根問底的探尋，又歸于波瀾不驚的平靜。
不過，這個小團隊沒有就此停下前行的腳步，他們準備繼續深入研究LEF-10的功能和結構，並著手開發一套鑑定朊病毒的原核系統，為更多想做朊病毒研究的學者提供方便可行的工具。
與此同時，已經有其他做病毒的課題組也在濃縮膠中發現了相似的「異常信號」，聯繫他們幫忙鑑定；還有的課題組找到他們合作解析LEF-10的蛋白結構。而這樣的合作，放在以前是不可能發生的事。
未來，還會有更多病毒中的朊病毒被學者們發現和研究。那時候，一定會有一篇來自中國的研究出現在他們的引文中：A viral expression factor behaves as a prion.
作者：Yuki、Nekout