蛋白質作為生命活動的物質基礎之一，也是生命活動的主要承擔者，是科研工作中的重要研究對象。而在這些精細化研究工作中，測定蛋白濃度，定量實驗，是探索蛋白生物學功能不可或缺的一個環節。依託不同的科學原理，目前已經發展出多種不同的蛋白測定方法，其中BCA法、Bradford法和UV法在科研實驗中應用最為廣泛，不過三種方法之間各有千秋，小P今天就和大家一起盤點盤點~
原理：BCA (Bicinchoninic acid，2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉），與含二價銅離子的硫酸銅組成BCA檢測試劑（商業試劑盒中，鹼性的BCA混合溶液與硫酸銅溶液分別包裝，標記為A液和B液，二者在實驗前比例混合，溶液呈綠色），在鹼性條件下,二價銅離子可被蛋白質還原成一價銅離子,一價銅離子能夠與BCA相互作用,兩分子BCA鰲合一個銅離子,形成穩定的紫色複合物，在562nm處顯示強吸光性。在一定濃度範圍內,複合物的光密度與蛋白質含量呈線性關係，通過酶標儀或者分光光度計以標準品蛋白做標準曲線，隨後檢測靶標蛋白562nm波長處的吸光值，即可換算出靶標蛋白濃度。
特點：BCA法作為已知最靈敏的檢測方法之一，靈敏度高，普通BCA試劑盒檢測範圍為20-2000μg/ml，增強型BCA試劑盒最低檢測濃度可到0.5μg/ml，檢測範圍廣且線性穩定；同時該方法操作較為便捷，正常情況下可在45分鐘內完成測定；不過由於反應中涉及「氧化」和「螯合」兩個過程，BCA法檢測結果會受到還原劑（如DTT，巰基乙醇等）、金屬離子螯合劑（如EDTA等）幹擾，不易受表面活性劑（Triton X-100、SDS等）影響。
原理：Bradford法也稱作考馬斯亮藍法（Bradford為發明人），考馬斯亮藍G250（Coomassie brilliant blue G250），是一種甲基取代的三苯基甲烷，每分子包含兩個SO3-H基團，呈酸性，該磺酸基團能夠通過範德華力與蛋白質的鹼性基團結合形成穩定的染料-蛋白複合物，在595nm波長處有最大吸收峰，游離考馬斯亮藍G250溶液呈現棕紅色，與蛋白反應之後變成藍色；並且在一定濃度範圍內，複合物的光密度與蛋白質含量呈線性關係。通過酶標儀或者分光光度計以標準品蛋白做標準曲線，隨後檢測靶標蛋白595nm波長處的吸光值，即可換算出靶標蛋白濃度。
特點：Bradford法作為另一種最靈敏的檢測方法，其靈敏度同樣可以達到微克級別；並且僅需一種反應試劑即可完成檢測，操作十分便捷；同時考馬斯亮藍染料與蛋白樣本結合所需時間極短，2分鐘即可形成穩定複合物，完成一次檢測耗時僅需幾分鐘。但是，由於蛋白-染料穩定複合物之間是分子間作用力，故Bradford法會受到表面活性劑（Triton X-100、SDS等）幹擾，除此之外，不同靶標蛋白中鹼性胺基酸（範德華力作用）以及芳香族胺基酸（疏水作用）含量不一，對考馬斯亮藍的結合能力差異較大；而且隨著蛋白濃度增加，線性關係會出現偏差。因此Bradford法與BCA法一樣，也是一種不完美的檢測手段。
[延伸]：檢測蛋白濃度的考馬斯亮藍和染色PAGE膠的考馬斯亮藍不是同一種物質，前者採用考馬斯亮藍G250，後者採用考馬斯亮藍R250，G250和R250分子基本骨架一樣，但是G250多了兩個甲基，與蛋白反應迅速，染膠慢且脫色困難，故用於蛋白定量；R250與蛋白反應較緩慢，染膠較快且易於洗脫，故用於PAGE膠染色。
原理：UV法即紫外分光光度法，蛋白質分子中的芳香族胺基酸，包括色氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸，含有可以吸收紫外光的共軛雙鍵，最大吸收峰在280nm波長處，且在此波長內吸收峰的光密度值與其濃度成線性關係。通過分光光度計檢測靶標蛋白280nm波長，即可根據Beer-Lambert定律（A=E*C*l；A代表吸光度，E代表消光係數，C代表蛋白質濃度，l代表光徑長度，其中消光係數可以根據蛋白質序列估測）換算出靶標蛋白的濃度。
特點：相較於上述兩種檢測手段，UV法一個最大的優勢就是不用額外添加檢測試劑，因此待測樣本是可以回收利用的，不影響活性；這也使得UV法具有無與倫比的便捷性和高效性，通過Nanodrop等儀器，我們甚至可以在幾秒內直接讀出一個蛋白樣本的濃度；UV法檢測的靈敏度同樣可以達到微克級別。UV法優勢明顯，缺點也極為突出。由於不同蛋白有不同的酪氨酸和色氨酸含量，對紫外光的吸收能力不同，故要準確測量，必須要有待測蛋白質或其它蛋白的純品作標準品參考；其次，很多化合物在280nm處有吸光值，對實驗結果造成幹擾，其中核酸影響尤為嚴重，核酸最大吸收峰在260nm處，故溶液中可能存在核酸時，必須同時測定OD260和OD280，然後根據兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響 。（一般常用Lowry-Kalcker公式：C(Protein)(mg/ml) = 1.45 * A280 - 0.74 * A260，或者Warburg-Christian公式：C(Protein)(mg/ml) = 1.55 * A280 - 0.76 * A260，來估算蛋白濃度。）
參考文獻：
1. 周躍男，王湛等.淺談蛋白質含量的定量檢測方法[J].食品研究與開發，2014.
2. 範雙雙，李正平.幾種檢測蛋白質濃度方法的比較[N].承德民族師專學報，2004
3. 範華傑，李聞捷.蛋白質定量方法的合理應用[J].中華國際醫學雜誌，2003.
通過以上對比我們不難發現，對於蛋白濃度測定，目前依舊沒有一個完美的解決方案。BCA法受還原劑、螯合劑幹擾；Bradford法受表面活性劑、蛋白差異幹擾；UV法受胺基酸組成幹擾、核受酸影響，每一種方法都有自身的優勢和缺陷，因此針對同一樣本採用不同的方法進行檢測，檢測結果也可能出現偏差。所以我們在使用時，應當根據實驗條件挑選最合適的檢測方法，這樣實驗數據才會更可靠!
以上就是三種常用蛋白定量方法差異盤點，
各位勤勞的科研園丁，
不知道你採用的是哪一種呢？