circRNA3-circRNAseq純測序數據分析文章-山羊(IF=4.011)

2021-02-14 紀偉講測序

Comprehensive analysis of circRNAs from cashmere goat skin by next generation RNA sequencing (RNA-seq)

絨山羊皮膚circRNA的綜合分析

 

期刊：Sci Rep (IF=4.011)                       

發表單位：瀋陽農業大學

本篇研究是一篇常規的描述性分析，意在描述不同品種山羊之間差異表達的circRNA，探索哪些circRNA主要與羊絨品質有關。我們做了測序，獲得了RNA組學數據，能不能直接寫個文章呢，是可以的，我們看一下本文的思路。收集試驗動物的皮膚組織後，主要使用生物信息學分析的手段研究。主要包括：不同品種山羊皮膚組織中差異表達的circRNA -> 差異表達circRNA來源基因的功能（GO、KEGG）分析 -> 差異表達circRNA與miRNA的互作網絡分析。此外，還通過qPCR驗證測序結果的準確性，以及探究了同品種不同類型皮膚組織中差異表達的circRNA。環狀RNA（circRNA）是具有共價閉合環狀結構的內源性非編碼RNA（ncRNA），主要是通過RNA選擇性剪接或反向剪接產生。circRNA在大多數真核生物中是已知的，並且非常穩定，但是有關circRNA調控羊絨細度的知識是有限的。在生長期，採集遼寧絨山羊（LCG）和內蒙古絨山羊（MCG）皮膚樣品，通過RNA測序鑑定差異表達的circRNA。與MCG皮膚樣品相比，鑑定了LCG中17個上調的circRNA和15個下調的circRNA。為了找到LCG中差異表達的circRNA，對LCG的粗型皮膚（CT-LCG）和LCG的細型皮膚（FT-LCG）中的10種候選circRNA進行了qPCR，證實了4個circRNA：ciRNA128、circRNA6854、circRNA4154和circRNA3620在LCG中表達差異顯著。從生物信息學的角度推斷了circRNAs-miRNAs的調節網絡，可能有助於了解circRNA參與調節羊絨細度的潛在分子機制。遼寧絨山羊（LCG）以高纖維產量著稱，內蒙古絨山羊（MCG）與其它絨山羊品種相比則生產高質量的羊絨纖維。一些研究表明，編碼和非編碼基因與絨生長的調節相關聯的，但關於皮膚中羊絨細度的分子調節尚無系統的研究。circRNA調節許多生物過程的基因表達，但circRNA參與羊絨形成的潛在機制尚不清楚。本篇研究旨在發現絨山羊皮中差異表達的circRNA。使用RNA-seq鑑定LCG和MCG皮膚樣品中的circRNA，並在山羊皮中獲得了數百種circRNA。為了進一步探索具有羊絨細度的circRNA及其潛在作用之間的關係，生成了一個監管網絡考慮了這些circRNA和miRNA之間的相互作用。本片研究的發現可能會提供有關絨山羊circRNA及其可能參與羊絨細度調節的新見解。

樣品製備

收集了三隻雌性成年遼寧絨山羊（LCG）和三隻成年雌性內蒙古絨山羊（MCG）的皮膚樣品，試驗動物均基於所有相同的條件，包括性別、年齡、餵養和生理狀況以及其它因素。同時，從遼寧絨山羊獲得了三個粗型（CT）皮和三個細型（FT）皮樣品。使用TopHat將clean reads與參考基因組對齊，StringTie用於組裝和定量表達的基因和轉錄物。CIRCExplorer2用於鑑定候選circRNA，Ballgown軟體包評估兩組之間circRNA的差異表達。p<0.05且|log2FC|>1被定義為顯著差異閾值。MIRANDA和TargetScan用於預測circRNAs-miRNA的相互作用，cytoscape用於可視化互作網絡。


首先是對circRNA測序數據、基因組比對率以及circRNA鑑定類型、基因組分布、長度概況等結果的描述，以反映本次對circRNA測序的概要。刪除低質量的原始reads後，LCG和MCG中clean reads的比對率分別為91.27％和84.93％。在LCG和MCG中分別檢測到7531和8943種circRNA，大多數為外顯子circRNA，長度在200到400 bp之間，大多數包含2-7個外顯子。來自circRNA的基因組位點在兩種類型的樣品中超過29個常染色體和X染色體。

圖1，來自遼寧絨山羊（LCG）和內蒙古絨山羊（MCG）皮膚組織中RNA-seq的circRNA信息。（a）circRNA的類型；（b）外顯子、內含子和基因間circRNA的分布；（c）circRNA中外顯子的數量；（d）circRNA的長度。

2    LCG和MCG中差異表達的circRNA

接下來，作者描述了兩種山羊品種之間差異表達的circRNA概況。在兩種山羊品種之間共鑑定出32個circRNA差異表達，包括17個顯著上調和15個顯著下調。為了確保RNA-seq策略的準確性，隨機選擇了6個差異表達的circRNA並在circRNA的連接區域內設計了特異性qPCR引物，確定了circRNA的表達水平高度一致以證實本次測序結果的可靠性。以及探究了circRNA與其來源的宿主基因的關係，首先進行宿主基因產生circRNA位置及結構的描述。共13320個circRNA來自4826個宿主基因，這些宿主基因中有45％僅生成一個circRNA，有20％生成了兩個circRNA，有8％生成了六個以上circRNA。circRNA平均由三個或四個外顯子組成。

3    差異表達circRNA宿主基因的富集分析

為了進一步描述circRNA的功能，對其所對應的宿主基因進行了常規的GO和KEGG功能分析。共有22個宿主基因富集了106個GO術語，並發現角化和中間絲組織與羊絨纖維的生長密切相關。KEGG分析富集了共43條途徑，硫中繼系統、硫代謝和糖胺聚糖降解途徑可能參與羊絨細度的調節。

圖5，差異表達circRNA宿主基因的基因本體（GO）分析。（a）前25個生物學過程、15個細胞成分和10個分子功能；（b）前20個GO term，點的顏色對應於不同的p值範圍，點的大小表示該途徑中的基因數量，富集因子表示GO中差異表達的circRNA數量/GO中circRNA的總數。

4    circRNA和miRNA之間的相互作用分析

通常認為circRNA發揮作用的形式是作為miRNA海綿，影響miRNA的功能而進一步調控基因表達。作者首先通過預測差異circRNA的潛在circRNA-miRNA相互作用構建共表達網絡，包括32個差異表達的circRNA和244個miRNA。並從中尋找關鍵的調控circRNA，發現circRNA6854可能充當多種miRNA的海綿，因其與很多miRNA具有結合作用。

圖7，circRNAs-miRNAs網絡。（a）32個差異表達的circRNA網絡，紅色和綠色分別代表上調和下調，藍色代表靶標miRNA。（b）10個候選circRNA的circRNA-miRNA網絡。

 


5    通過qPCR驗證差異表達的circRNA

上述均在描述兩種不同品種山羊差異表達circRNA及其可能對羊絨質量的影響。在另一方面，作者也期望關注同一品種的山羊，通過比較其不同類型皮膚組織中circRNA表達的差異，驗證先前尋找到的重要circRNA，並確定這些circRNA對調節遼寧絨山羊（LCG）皮膚組織中羊絨細度是否也是至關重要的。作者選擇了10種差異表達的circRNA並設計了特異性qPCR引物去驗證，證明這些circRNA在LCG皮膚中顯示出相似的表達模式，其中大多數在粗型皮膚中表現出較高的表達水平。此外，ciRNA128、circRNA6854、circRNA3620和circRNA4154的結果在RNA-seq和qPCR中表達差異顯著，表明它們可能在具有不同纖維直徑的絨山羊中發揮積極作用。本篇研究通過RNA測序分析，鑑定了山絨山羊皮中的13320個circRNA，其中32個circRNA被發現是差異表達。qRT-PCR的結果證實了四個circRNA（ciRNA128、circRNA6854、circRNA4154和circRNA3620）在CT-LCG和FT-LCG中差異表達。差異表達的circRNA的宿主基因主要在角質化和中間絲組織中富集。在生長期絨山羊皮中構建了circRNA和miRNA的整合調控網絡。這項研究可能有助於更好地了解山羊皮膚中的circRNA。（1）首先在測序後比對基因組鑑定circRNA，描述測序數據及circRNA類型和分布概要；（2）比較組間差異表達的circRNA，確定可能與功能相關的組分；（3）功能分析通過兩點，一是circRNA來源宿主基因的功能分析，即通過基因的GO、KEGG功能描述circRNA功能；二是circRNA的miRNA海綿功能的分析，預測互作miRNA並通過miRNA描述功能，闡述抑制miRNA的circRNA可能功能。可詳見原文討論部分。（4）結合qPCR作為驗證，這也是純測序描述試驗中常附帶的部分。本篇文章中所有的分析，如circRNA測序、差異表達分析、功能富集分析、靶miRNA預測及火山圖、熱圖、氣泡圖、網絡圖可視化等，我們均可以提供。

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劉堯丨寫

李紀偉丨審

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