2020年4月28日，南通大學的鞠少卿教授在Cancer Letters （IF=6.508）雜誌上在線發表了一篇題為「Translatable circRNAs and lncRNAs: Driving mechanisms and functions of their translation products」的文章，闡述circRNA和lncRNA翻譯起始機制，及其翻譯產物在癌症中的功能。最後介紹了這些生物活性蛋白/肽的檢測、驗證和功能性研究的工具和方法（[1]）。
lncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。circRNA是lncRNA中的一類，由編碼蛋白質的外顯子反向剪接產生的單鏈共價閉合環狀RNA。最近，lncRNA和circRNA顯示具有開放閱讀框（ORF）並可以編碼蛋白質/肽。已經在果蠅，小鼠和人成肌細胞以及不同的癌症如神經膠質瘤、肝細胞癌和結腸癌中鑑定出幾種可翻譯的circRNA和lncRNA。circRNA是通過內部核糖體進位點（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）來啟動翻譯。在本文中，作者回顧了circRNA和lncRNA翻譯的機制和產物功能。此外，介紹可用於識別和驗證這些生物活性蛋白/肽在生理和癌症狀態下功能的研究方法和工具。
1.1 帽子依賴性的翻譯起始
RNA根據其編碼蛋白質的能力被分為mRNA或ncRNA。mRNA作為模板，核糖體將其直接翻譯成相應的蛋白質。帽子依賴性啟動是真核生物翻譯啟動的主要機制。帽子結構由mRNA 5『端的7-甲基鳥苷(m7G)組成，可被真核細胞翻譯起始因子4E(eIF4E)識別。eIF4E與eIF4A和eIF4G相互作用，形成初始複合物eIF4F。隨後，eIF4F複合物促進43S前起始複合物(PIC)的募集，PIC由小核糖體亞基(40S)、eIF1、eIF2、eIF3、eIF5和Met-tRNA組成。然後43S PIC連接到mRNA的5『端，被eIF4F複合物預激活，並開始沿5』到3『方向掃描。在這個過程中，被eIF5B激活的核糖體大亞基（60S）被招募形成80S起始複合物，該複合物啟動了肽的合成。
1.2 IRES依賴的翻譯起始
由於缺少5『端的帽子結構，因此早先認為circRNA不具有編碼蛋白質的能力。然而，IRES元件的發現對這一理論提出了質疑。最初，IRES元件是在某些病毒和細胞mRNA內被發現。40S亞基通過直接與IRES元件結合或首先在mRNA的5『端結合，然後轉移到IRES來介導翻譯的起始，而不需要事先掃描。通常這些IRES元件需要IRES輔助因子(ITAF)的幫助來在mRNA上招募核糖體並啟動翻譯。IRES也可以應用於circRNA，體外合成了含有IRES元件的circRNA，環化後得到預測的蛋白產物。然而，沒有IRES的circRNA不能直接合成蛋白質。事實證明，在體內含有IRES的circRNA也可以翻譯成蛋白質。例如，由於IRES元件，果蠅中circMb1可以有效的翻譯蛋白質。此外，Legnini等人發現circ-ZNF609的非翻譯區（UTR）可以增強IRES依賴性翻譯。這些進一步證明IRES通過招募核糖體來驅動circRNA的翻譯，這種翻譯不依賴於帽子結構。
下列標準可以確定IRES介導的circRNA翻譯：
（1）circRNA上有一段未翻譯的RNA序列，稱為IRES，它可以摺疊成類似於起始tRNA的結構，並招募更多的核糖體。
（2）正常情況下，IRES不與eIF結合，而是與一類稱為ITAF的蛋白質結合。ITAF的作用是將核糖體募集到circRNA的內部結構，以啟動蛋白質翻譯。
（3）可能存在IRES增強子，類似於circ-ZNF609的UTR元件。
有趣的是，當細胞處於壓力狀況下或帽子依賴性翻譯被阻斷時，翻譯通過IRES元件啟動，以對生理和環境應激狀況做出反應，如缺氧、熱休克或病毒感染。在這些情況下翻譯的蛋白質通常對維持細胞在應激條件下的存活至關重要。
1.3 m6A依賴性的翻譯起始
除了IRES外，含有m6A位點的短序列也可以啟動circRNA的翻譯。m6A是真核細胞中含量最豐富的RNA修飾，它是在RNA腺苷的N6位增加一個甲基。Yang等人在探索IRES介導circRNA的翻譯中，發現起始密碼子周圍含有RRACH基序的陰性對照也可以啟動翻譯，原因是該基序可以被m6A修飾。因此，初步證實了m6A修飾在circRNA翻譯中的重要性。通過分析甲基化RNA免疫沉澱測序(MeRIP-seq)數據，研究人員發現內源性circRNA確實包含m6A修飾位點，m6A傾向於出現在circRNA的較大外顯子區域，並且更多地集中在外顯子區域的上遊和中部，顯示出細胞特異性。m6A修飾是通過甲基轉移酶3(METTL3)和甲基轉移酶14(METTL14)參與。RNA免疫沉澱測序(RIP-seq)證實YTHDF1和YTHDF2參與circRNA翻譯中m6A的識別。此外，除RIP外，交聯免疫沉澱測序（CLIP-seq）和免疫共沉澱分析（CO-IP）還顯示YTHDF3與翻譯起始因子eIF4G2強烈的相互作用，從而促進翻譯。綜上所述，這些研究表明，起始轉錄因子eIF4G2和YTHDF1/2/3參與了m6A誘導的circRNA的翻譯，並且這一過程被METTL3/14所增強。
下列標準可以確定m6A介導的circRNA翻譯：
（1）確認circRNA中存在m6A修飾。首先，可以進行序列分析來驗證circRNA中是否存在m6A基序，然後可以使用meRIP-seq來直接篩選出m6A修飾的circRNA。
（2）證明circRNA結合核糖體的能力，這可以通過多核糖體分析來實現。
（3）確定與circRNA結合的核糖體是否正在翻譯,RNA下拉實驗可用於驗證YTHDF1/2/3或其它翻譯啟動分子，以預測翻譯啟動。
（4）circRNA翻譯的蛋白質產物鑑定，可以使用專門製備的抗體或質譜進行western blotting來分析和鑑定翻譯產物。
有報導闡述在熱休克條件下，m6A介導的circRNA的翻譯增加，這表明circRNA編碼蛋白可以在應激反應中發揮作用。但是，在環境壓力下m6A驅動的circRNA翻譯啟動還有待進一步研究。IRES和m6A都是circRNA的潛在翻譯驅動因子。這兩種機制在細胞應激反應、發育、凋亡和細胞周期調控中發揮重要作用，提示circRNA翻譯產物也可能影響這些過程。
1.4 sORF依賴性的翻譯起始
lncRNA一般指長度大於200nt的RNA，由於缺乏開放閱讀框(ORF>100 aa)，被認為是不可翻譯的。然而，最近的研究發現，人體內各種短的或小的ORF(sORF或smORF)可以編碼多肽。同時，在非編碼區也發現了sORF，可以編碼參與調節肌肉功能和細胞代謝的小功能肽。2011年，Ingolia等人使用核糖體圖譜證明大的基因間非編碼RNA(LincRNA)與翻譯機制相關，這也已初步證明lincRNA具有編碼潛力。2013年，Slavoff 等人通過多肽組學檢測到體內大量的小肽，一部分是從lncRNA中衍生出來的，並通過功能實驗進行了驗證。2014年，Pauli等人發現在斑馬魚胚胎形成的早期階段，由lncRNA產生的一種幼兒肽起到G蛋白偶聯受體激活劑的作用，並促進胚胎的形成。研究人員命名了一種新肽短開放閱讀框（DWORF），並表明它可以刺激控制肌肉收縮的鈣通道。這一發現為增加肌肉收縮提供了一種途徑，並且可能是治療心臟病的替代方法。因此，這些新發現強調了一些小的生物活性蛋白/肽隱藏在基因組區域中，並由ncRNA編碼，這些蛋白質/肽可能具有關鍵的功能，而不論其大小如何。
2.1 circFBXW7、circSHPRH、circ-LINCPINT和circAKT3在膠質母細胞瘤中的作用
RNA-seq顯示circFBXW7在人類神經膠質瘤中被下調，通過CircRNADb資料庫分析了circFBXW7中的ORF，並使用雙螢光素酶載體系統驗證了IRES活性。用特異性抗體對預測的翻譯產物進行驗證，並通過液相色譜-串聯質譜（LC-MS）鑑定其胺基酸序列，證實circFBXW7編碼一種稱為FBXW7-185aa的新型21 kDa蛋白。FBXW7-185aa與USP28競爭性相互作用並釋放FBXW7α去降解c-Myc，從而誘導細胞周期停滯並減少神經膠質瘤細胞的增殖。此外，circ-FBXW7和FBXW7-185aa可以作為膠質母細胞瘤的獨立預後指標。
Zhang等人使用RNA-seq與GEO資料庫一起鑑定了差異表達的circRNA，之後查詢CircBase資料庫，然後選擇出circSHPRH。與circFBXW7類似，在circSHPRH中預測到ORF，並確認了其IRES的活性。circSHPRH可翻譯為含146個胺基酸的蛋白質，稱為SHPRH-146aa，晶片分析表明SHPRH-146aa參與中樞神經系統癌症的發展以及蛋白泛素化途徑。通過搜索Uniprot資料庫，發現SHPRH-146aa內部有兩個泛素化位點。有趣的是，SHPRH-146aa可能保護全長SHPRH免受DTL誘導的泛素化作用，從而在體內促進增殖細胞核抗原（PCNA）轉化。因此，在臨床上，SHPRH-146aa也可能是膠質母細胞瘤的預後標誌物。
circ-LINCPINT是由LINC-PIN外顯子2環化形成的。免疫螢光法（IF）顯示，circ-LINCPINT中的sORF可以編碼一個含87個胺基酸的肽，叫做PINT87aa。使用了兩個專門靶向circ-LINCPINT環化位點的siRNA，來證明PINT87aa由circ-LINCPINT產生，而不是由LINC-PINT的線性形式產生。在雙螢光素酶載體系統中，在sORF上遊鑑定出了有活性的IRES。值得注意的是，PINT87aa在神經膠質瘤組織中下調，並與神經膠質瘤的臨床預後負相關。此外，PINT87aa抑制神經膠質瘤細胞的增殖，並與聚合酶相關因子（PAF1）複合物結合，從而抑制多個癌基因的轉錄延伸。
在最近的一項研究中，Zhang的研究小組報導了一種由circAKT3編碼的新型含174個胺基酸的蛋白。AKT3-174aa在神經膠質瘤組織中也被下調，並且可以充當腫瘤抑制因子。AKT3-174aa與p-PDK1相互作用，以防止AKT Thr-308磷酸化。PDK1介導的Thr-308磷酸化激活AKT是激活RTK / PI3K / AKT信號通路的關鍵步驟。因此得出結論，在膠質母細胞瘤（GBM）的腫瘤產生過程中，AKT3-174aa可以抑制AKT激活誘導的惡性表型。因此，該肽可能是診斷和治療膠質母細胞瘤的潛在靶標。
2.2 Circβ-catenin在肝細胞癌中的作用
使用CircRNADb和CircBase資料庫，研究人員預測circβ-catenin序列中ORF和IRES的存在。使用雙螢光素酶報告系統檢測IRES的活性，使用質譜儀（MS）確認了含370個胺基酸的蛋白，命名為β-catenin-370aa。β-catenin-370aa與GSK3β相互作用，並通過拮抗GSK3β誘導的β-catenin磷酸化和降解來穩定全長β-catenin，從而激活Wnt信號通路。
2.3 circPPP1R12A在結腸癌中的作用
研究人員發現具有ORF序列的circPPP1R12A可編碼功能蛋白circPPP1R12A-73aa。circPPP1R12A-73aa在體外和體內均能促進結腸癌（CC）的增殖、遷移和侵襲。為了確定可能的信號傳導途徑，使用了RNA-seq和KEGG途徑資料庫分析。最後，發現circPPP1R12A-73aa可以通過激活Hippo-YAP信號通路來調節CC的生長和轉移。circPPP1R12A是第一個可以在CC中編碼小蛋白並可以作為潛在治療靶點的circRNA。
2.4 LncRNA HOXB-AS3在大腸癌中的作用
GEO資料庫的分析表明，在原發性和高度轉移性癌細胞中，lncRNA HOXB-AS3的表達降低。核糖體分析顯示lncRNA HOXB-AS3與核糖體結合，這表明lncRNA HOXB-AS3可能編碼蛋白質或小肽。之後鑑定出lncRNA HOXB-AS3上的 sORF具有編碼含53個胺基酸的肽的潛力，然後使用特異性抗HOXB-AS3抗體和MS確認了內源性HOXB-AS3肽的存在。機制上，HOXB-AS3肽通過阻斷hnRNP A1依賴性丙酮酸激酶M（PKM）剪接、miR-18a加工和有氧糖酵解作用來抑制腫瘤發生。在大腸癌（CRC）患者中，HOXB-AS3肽表達量低表現出更高的侵襲性病理特徵和較差的預後，提示HOXB-AS3肽可能作為CRC的診斷指標。
1. S. Kong, M. Tao, X. Shen, S. Ju, Translatable circRNAs and lncRNAs:Driving mechanisms and functions of their translation products, Cancer Letters, https://doi.org/10.1016/j.canlet.2020.04.006
轉載請聯繫郵箱授權：circRNA@163.com
「circRNA」微信公眾平臺由
『廣州吉賽生物科技股份有限公司』運營，
旨在為circRNA研究同行
提供最新科研資訊和研究方法，
服務廣大生命科學工作者和醫學工作者。
如果您有好的文章或Idea，
千萬別讓它埋沒，
歡迎大家分享或投稿。
小編在編輯微文時特別鳴謝，
另有驚喜送出！
投稿郵箱：circRNA@163.com