[文獻推送]Angew.Chem.|通過阻斷自由基介導的去偶聯作用對肽和蛋白質進行位點選擇性修飾

2021-03-05 王曉劍課題組

[文獻推送]Angew.Chem.|通過阻斷自由基介導的去偶聯作用對肽和蛋白質進行位點選擇性修飾

隨著以典型胺基酸為靶點的位點選擇性化學修飾的不斷發展，已成功地在天然肽和蛋白質中可控地安裝所需的功能手柄成為可能。這些技術促進了多肽結合物的發展，以推進治療學、診斷學和基礎科學。為了廣泛應用於肽/蛋白質生物偶聯，這種反應必須是化學選擇性的、高產率的、快速的和操作簡單的。基於此，今日分享來自英國諾丁漢大學Nicholas J. Mitchell等人的研究成果Site-Selective Modification of Peptides andProteins via Interception of Free-Radical-Mediated Dechalcogenation，該論文發表在Angew.Chem.上。

作者報導了一種通過自由基介導的脫滷功能化肽和蛋白質的多用途和選擇性方法。經隨已報導利用不同典型胺基酸對肽和蛋白質進行位點選擇性功能化方案的分析，作者提出自己的設想。選擇半胱氨酸（Cys）為研究目標，半胱氨酸（Cys）僅佔蛋白質組的2%，由於這種有限的存在，再加上巰基增強側鏈的親核性，以及通過定點突變使非天然半胱氨酸（Cys）易於結合，以這種殘基為目標的反應已被工業界和學術界廣泛採用。同時，硒代半胱氨酸（Sec）是半胱氨酸（Cys）的另一種結合方式，這種胺基酸由於硒的極化率增加，其硒醇部分表現出比半胱氨酸（Cys）的巰基更強的親核性及低氧化還原電位，容易被氧化。二硒化硒酯連接技術，利用兩種含硒片段實現快速、無添加劑的肽連接，分別通過脫硫和脫硒促進連接後內部Cys和Sec殘基轉化為丙氨酸（Ala）的方案，允許在含有更豐富殘基的位點進行肽連接。在這兩種情況下，脫硫和脫硒途徑（由磷化氫介導）都是通過自由基過程進行的（圖2）。含半胱氨酸肽的脫硫需要先形成一個噻吩基，並加入磷化氫（TCEP-三（2-羧乙基）磷化氫），形成磷醯基自由基。Sec在環境條件下會自發地發生這種反應。隨後硫膦醯/硒化物的C−S/C−Se鍵均裂產生丙氨醯自由基（釋放硫膦/硒化物）。這種中間自由基產物將從硫醇添加劑中提取H原子，在該位置產生Ala殘基。在脫硒的情況下，丙氨醯自由基可被過氧鹽（氧酮）或O2捕獲，在連接處安裝羥基，從而生成絲氨酸。

但是，作者了解到的是，自由基介導的脫滷作用還沒有被探索作為一種將感興趣的基團安裝到肽和蛋白質中的方法。所以作者設想使用合適的功能化誘捕劑截獲這一途徑，將有可能成為這一領域合成方法的有力補充（圖3）。持久性自由基TEMPO（2,2,6,6-四甲基-1-哌啶-1-氧基），由於空間屏蔽作用，硝基自由基部分是穩定的，在這種情況下是理想的捕獲試劑。但關鍵的是，通過所描述的途徑在Sec或Cys的β-碳上產生和捕獲自由基，並能保持目標殘基的α-立體中心的完整性。

首先，作者合成了小的含Sec的模型肽1 a（H-UAF-OMe）對反應進行探索並優化，在標準脫硒條件下進行反應，使用HPLC檢測發現，反應在37°C下進行，6小時內可以完全轉化，且從合適的供體中沒有發現Ala副產物，因此持久的TEMPO自由基能夠成功截獲這一途徑，定量轉化為所需的共軛化合物。為了提高綴合率，作者優化了幾個變量，包括：溫度、酸鹼度、試劑的化學計量、助溶劑和各種添加劑的使用（見表1）。

作者先改變TCEP的當量，發現如果將過量的TCEP降至25當量，觀察到反應以稍慢的速度進行，使用5當量，反應不能完成（圖4 B）。作者嘗試了幾種不同的添加劑（圖4D），每種添加劑都能成功地提高轉化率，使得反應在2小時內完全轉化，Mn(OAc)3的轉化最快。

作者製備了攜帶Sec（H-d-UAF-OMe）的D異構體的模型肽1-b，並按照方案A生成共軛物2-b。經過比較差向異構體2-A和2-b的1H-NMR，可以清楚地發現2-b觀察到的信號位移在2-A的核磁共振譜圖中不存在，反之亦然。因此，在整個共軛過程中，目標殘基處立體化學的完整性保持不變（圖5）。

在確定反應條件後，作者合成了模型肽H-CHISKY-NH2驗證該方案在含有硒酯肽的N末端Cys殘基的適用性發現產生不想要的硒酯。因此，作者將模型肽改為兩步方案，連接兩種肽後，提取DPDS，添加羥胺，並純化連接產物，以77 %的產率得到所需的肽35。當使用炔丙基-TEMPO4應用於純化的連接產物時，發現在起始肽的2.5 mM處需要稍微高的Mn(OAc)3來成功修飾內部Cys殘基。這些條件在4小時內以81 %轉化率提供所需的共軛物28。使用肽35與炔丙基-TEMPO 4和吉西他濱-TEMPO 7在可分離的範圍內重複接合，在相同的時間，分別以67%和62%的分離產率（兩步52%和48%）產生所需的接合物。

作者使用模型肽25（H-UHISCY-NH2）對一鍋連接的研究表明，可以在Cys存在下選擇性修飾Sec殘基。為了進一步探索這種選擇性，使用炔丙基-TEMPO 4對肽25進行溫和共軛方案C（即無Mn(OAc)3）並純化以得到68%產率的單修飾肽36，並結合其他的探索證明通過調節反應條件可以選擇性地將替代部分安裝在Sec和Cys殘基上。

在不同的pH值（2-9）、升高的溫度、暴露於紫外線輻射以及存在添加劑（包括VA-044（自由基引發劑））的情況下，研究氨基氧基連接體的穩定性，發現只有在弱酸性條件、低氧化態、過渡金屬存在下，氨基氧基連接體是不穩定的。隨後作者將該方案應用於純化的結合物28，成功且非常乾淨地釋放炔丙基。

為了評估這種方法作為在絲氨酸殘基上實現肽連接的潛在技術，作者研究了一鍋DSL-TEMPO共軛還原裂解方案（圖7）。利用標準DSL條件截獲硒酯模型23和二硒醚模型21。發現該方案是與先前報導的用於Ser可編程連接的Oxone-TCEP方法相當的。

作者將該反應應用於兩個更大、更複雜的多肽體系。為了充分展示一鍋截獲-接合方案的範圍，ZEGFR:1907（來源於免疫球蛋白結合蛋白a的58肽）合成為兩個片段：硒酯42（胺基酸1-28）和二硒醚43（胺基酸29-58）。在標準DSL條件下連接這兩種肽，並在己烷提取沉澱的DPD後，使用方案A將炔丙基-TEMPO-trap 4結合。以42%一鍋產率分離所需的結合物44（圖8）。

最後，作者通過在大腸桿菌中的重組表達製備了泛素（45）的K48C突變體觀察到蛋白質內的Cys修飾需要比方案D中的稍微高的當量。在1 mM蛋白質濃度下，丙炔基-TEMPO 4使用100 mM TCEP、5 mM 4和20 mM Mn(OAc)3在50 s℃下接合2小時（方案E）。產物通過製備性高效液相色譜純化，並以62 的產率分離出所需的結合物46（圖 9）。

最後，作者成功地探索了一種通過自由基介導的脫滷功能化肽和蛋白質的多用途和選擇性方法，該反應快速、操作簡單且具有化學選擇性。所得的氨基氧基接頭在各種條件下是穩定的，並且在低氧化態過渡金屬存在下可選擇性裂解。在複雜的肽系統和重組表達的蛋白質中也適用。

【文章連結】

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202006260

【D O  I】

https://doi.org/10.1002/anie.202006260

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