大家好，本周為大家帶來一篇發表在Anal. Chem.上的文章，Facile Determination of Phosphorylation Sites in Peptides Using Two-Dimensional Mass Spectrometry [1]，文章通訊作者是英國華威大學的Peter B. O』Connor教授。
蛋白質磷酸化是調控細胞間過程的主要已知信號轉導機制之一，因此對蛋白質磷酸化位點的確定十分重要。紅外多光子離解（IRMPD）是一種通常使用CO2雷射的碎裂技術，其碎裂模式與CID相似。磷酸鹽在質譜中被認為是不穩定的基團，並在CID或IRMPD碎裂模式下產生診斷離子。磷酸化肽段的碎裂方式取決於肽的電荷狀態和磷酸化的胺基酸類型，並導致正離子模式下的磷酸（H3PO4）或偏磷酸（HPO3）的丟失和負離子模式下的亞磷酸酯（PO3）的丟失。通過診斷離子或母離子的中性丟失，可以在複雜混合物中選擇性檢測磷酸化的肽段。二維質譜（2DMS）是一種LC-MS/MS的替代技術，可以直接注入複雜樣品，而無需使用液相色譜或四極杆對成分進行分離，並保留母離子和碎片離子的相關性。在傅立葉變換迴旋共振質譜中的2DMS使用非標準脈衝序列。在激發/檢測前，離子在ICR池內沿徑向做迴旋運動，第一次激發後，經歷延遲及二次激發。脈衝序列根據m/z在空間上分離離子。IRMPD或ExD均可用於解離空間分辨的母離子。隨著延遲間隔的逐漸遞增，離子受脈衝程序調控進/出中心離子裂解區域，信號被連續掃描並記錄。在每一次掃描中，在不同半徑軌道的離子將經歷不同程度的裂解。2DMS譜圖是母離子m/z、碎裂離子m/z和強度的三維圖，通常顯示為等高線圖。如圖1b所示，顯示了實際三維峰形沿頂部和側面的投影，並表明，由於傅立葉變換，2DMS在兩個維度上都提供了完整的峰形，這意味著每個維度上的峰質心比整個峰寬更精確。
本文，作者通過紅外多光子解離二維質譜（IRMPD 2DMS）技術有效地檢測和鑑定磷酸化肽段。磷酸蛋白質組學的局限性之一是磷酸肽的丟失，因為它在樣品製備或隨後的反相色譜中增加了親水性。而在2DMS工作流程中，直接進樣策略可以避免這些丟失。納米電噴霧離子源還可以檢測低濃度的磷酸肽。此外，2DMS中中性丟失譜線的提取可選擇性地鑑定磷酸肽。
作者通過對10種磷酸化肽段（Ph01- Ph10）的混合物進行檢測，結果如圖1所示。圖1A將完整的2D譜圖顯示為等高線圖。通過圖1A中x = y對角線提取的自動相關線（圖1C）顯示了所有發生解離的母離子，類似於標準MS掃描。圖1B中，磷酸肽Ph01顯示為電荷狀態2+。在m/z 420時，水平軸的解析度約為140 000，這與在12 T時的0.4194 s瞬態（1 MW）相一致。垂直軸的解析度在m/z 420時約為1 400，這與第二維中收集了8192個數據點相一致。圖1D, E是提取的中性丟失線，對應於49和32.5 Da的丟失，分別對應於2+和3+電荷狀態下H3PO4（98 Da）的丟失。中性丟失線的提取可迅速揭示混合物中的磷酸化肽段。
圖1. （A）磷酸肽混合物的完整2DMS光譜，紫色為2+，粉紅色為3+;（B）[Ph01+2H]2+垂直和水平軸上的解析度；（C）自動相關線顯示所有碎片離子的母離子（類似於1DMS譜）；（D,E）提取的2+和3+磷酸鹽中性（H3PO4）丟失線。
在提取的磷酸鹽丟失線中發現了十種磷酸肽混合物中的九種，沒有找到Ph07。沒有檢測到磷酸鹽遷移。對於每個檢測到的母離子，可以提取一條包含該母離子的碎片離子的水平線。表1包含了從2DMS光譜中提取的磷酸肽的所有信息，標出了碎裂位點，並突出了磷酸化區域。在大多數磷酸肽中，未檢測到具有磷酸基團丟失和含磷酸基團的碎片離子。因此，使用所有碎片離子確定磷酸基團的位點。IRMPD脈衝長度是在1DMS實驗中針對中等長度磷酸肽裂解化預先優化的，因此，Ph03、Ph04、Ph05，Ph06和Ph08具有高裂解覆蓋率（~75%），較小的肽Ph01和Ph02過度斷裂，Ph09和Ph10由於其較長的長度而顯示出較低的裂解覆蓋率（~25%）。Ph02酪氨酸上的磷酸基團在b3、pb4和pb5處裂解。因此，在酪氨酸上的磷酸基團的定位丟失了，在絲氨酸上的磷酸根基團保留下來。下列九個磷酸化肽段中共有13個磷酸化位點，其中11個位點被確定。
表1. 通過2DMS觀察到的九種檢測到的磷酸肽的碎裂覆蓋率。對於磷酸肽使用IRMPD時，峰度最強的碎片通常會丟失磷酸鹽。碎片離子的豐度與母離子具有相同的調諧頻率，但相位相反（圖2A）。所有檢測到的母離子均具有不同的m/z值以及不同的迴旋頻率。每次掃描過程中受豐度調節的頻率使得複雜混合物中不同母離子及其對應碎片離子得以歸屬並區分。丟失磷酸基團的Ph05碎片強度很低（圖1D）。這可能是因為Ph05上具有與磷酸基團形成氫鍵的精氨酸、絲氨酸和穀氨酸，起到了穩定磷酸基團的作用。2DMS實驗可以使所有磷酸化肽段同時斷裂，而無需事先分離；並且數據表明，絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化的肽段之間沒有表現明顯的裂解差異。在中性磷酸鹽丟失譜線中未檢測到Ph07，經過實驗證明，這不是由於2DMS實驗造成的，這是因為Ph07是一種非常疏水的肽，它在直接進樣實驗中使用的拉制玻璃毛細管的玻璃表面上進行了吸附。
圖2. 磷酸化肽段Ph06的實例。（A）Ph06母離子（黑色）和其丟失磷酸鹽的碎片（紅色）的強度調製；（B）提取的Ph06碎片離子。
綜上所述，作者證明了二維質譜能夠表徵磷酸肽的混合物。中性丟失線的提取能夠對其進行選擇性識別。總共90％的磷酸肽在一次直接進樣實驗中被分配，而無需進行液相色譜或四極杆分離。實現了高裂解覆蓋率，並且在斷裂過程中磷酸鹽的位點沒有丟失。作者提出，為了研究完整的磷酸化蛋白質組，可以在寬的m/z四極杆分離窗口上進行2DMS實驗。每個窗口將具有自己優化的IRMPD脈衝長度，具體取決於質荷比窗口中母離子的大小。本方法顯示了獨立於液相色譜的、不依賴數據的磷酸化肽段分析方法。
撰稿：胡鷗
編輯：李惠琳
文章引用：Paris, J.; Morgan, T. E.; Wootton, C. A.; Barrow, M. P.; O'Hara, J.; O'Connor, P. B. Anal Chem 2020, 92, 6817-6821
[1] Paris, J.; Morgan, T. E.; Wootton, C. A.; Barrow, M. P.; O'Hara, J.; O'Connor, P. B. Anal Chem 2020, 92, 6817-6821