Nat. Chem. Biol. | 實現哺乳動物細胞中硫酸化的遺傳編碼

2021-02-14 王初課題組
大家好，今天給大家分享NCB上的這篇文章，文章的通訊作者是來自波士頓學院化學系的的Abhishek Chatterjee助理教授，他們課題組一方面研究利用有用的生化和生物物理探針對活細胞中任意選擇的蛋白質進行位點特異性標記，以研究其在生理條件下的功能；另一方面通過合理的定向進化，開發具有新功能的蛋白質。

酪氨酸殘基的硫酸化是一種翻譯後修飾(PTM)，只發生在多細胞真核生物中。高爾基體中的tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1和TPST2)使用3-磷酸腺苷-5 -磷酸硫酸鹽作為硫酸鹽供體來連接這個PTM，這種修飾在免疫、激素功能、凝血和宿主病原體相互作用等多種生理過程中起重要作用。據估計，在真核生物蛋白質組中大約1%的酪氨酸殘基是硫酸鹽化的，但對大多數酪氨酸殘基的生理作用仍知之甚少。目前現有的方法存在天然位點的不完全硫酸化，不能只修飾感興趣的位點等缺點，利用遺傳密碼擴展技術將O-磺基酪氨酸(sTyr)位點特異地結合到蛋白質中的能力可以克服這些問題。來自詹氏甲烷球菌的tyrosyl-tRNAsynthetase (MjTyrRS)/tRNApair已經被改造成位點特異性地將sTyr整合到大腸桿菌表達的蛋白質位點中，但是由於交叉反應，MjTyrRS/tRNApair不能用於真核生物的非天然胺基酸(ncAA)誘變。

本文作者發展了一個工程化的tyrosyl-tRNA synthetase/tRNA pair，實現了在大腸桿菌和哺乳動物細胞中通過響應UAG密碼子，在翻譯過程中將O-磺基酪氨酸共價連接到蛋白上。首先作者將來源於大腸桿菌中的tyrosyl-tRNAsynthetase (EcTyrRS)/tRNA pair進行改造和突變篩選，發現L71和D182分別突變為V和G,L186要麼保守(VGL)，要麼突變為M(VGM)，這兩個突變體的活性位點的擴大與需要容納額外的硫酸鹽基團是一致的。接下來作者通過在大腸桿菌中表達sfGFP, 評價了這兩種EcTyrRS突變體(VGL和VGM)的磺基酪氨酸的插入效率，實驗發現工程化的EcTyrRS/tRNA能夠選擇性地響應UAG整合sTyr。然後利用EGFP在哺乳動物細胞中證明了這兩個突變EcTyrRS/tRNA pairs也能夠選擇性地響應UAG整合sTyr。最後，作者使用人肝素輔助因子II (HCII)作為模型系統，以證明他們發展的突變EcTyrRS/tRNA pairs能夠使真核蛋白在天然位點上容易表達並均一性地硫酸化。

本文作者：ZX

原文連結：https://www.nature.com/articles/s41589-020-0493-1

原文引用：10.1038/s41589-020-0493-1

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