在開始詳細介紹哺乳動物細胞表達系統前,首先——什麼是蛋白表達系統?蛋白表達系統是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現外源基因在宿主中表達的目的。一般由以下幾個部分組成:宿主表達蛋白的生物體。可以為細菌、酵母、植物細胞、動物細胞等。由於各種生物的特性不同,適合表達蛋白的種類也不相同。載體載體的種類與宿主相匹配。根據宿主不同,分為原核(細菌)表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導,外源基因可以在宿主中表達。輔助成分有的表達系統中還包括了協助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-杆狀病毒表達體系中的杆狀病毒。
基因工程和克隆飛速的發展,為研究領域開闢了表達和分離異源蛋白質的許多可能性。基於蛋白質表達系統在各類實驗中的廣泛應用,在蛋白表達的系列推送內,會帶大家了解走進各類具體蛋白表達體系,為正在因為蛋白質製備而煩惱的你,帶來更系統更全面的蛋白表達資料。接下來要介紹的哺乳動物表達系統,高效調控蛋白質準確摺疊表達的優秀方式,您值得了解一下!
哺乳動物表達系統的原理or實驗流程是什麼?
圖1 哺乳動物細胞表達系統流程圖
哺乳動物蛋白表達系統的優勢能實現翻譯後修飾及正確的蛋白摺疊復性:哺乳動物為真核細胞,細胞器可以對蛋白正確摺疊加工。表達水平高:載體可在哺乳動物細胞中高表達重組蛋白,表達量可高達1-3g/L蛋白表達高效穩定:高效啟動子控制,穩定表達,並可以選擇多種表達系統選項:瞬時表達、穩定細胞株表達、營養缺陷型細胞株表達(DHFR/GS)、大規模懸浮細胞表達等適合大規模蛋白表達:最常用的哺乳動物表達宿主細胞(HEK293和CHO),使用懸浮細胞培養,可以在一個月內可產生數克級蛋白。
當然哺乳動物表達系統也有它的劣勢:曾經,使用哺乳動物細胞表達重組蛋白質的最大問題是是效率低,所表達的蛋白質水平低。然而,諸如HEK293和CHO的細胞系已經分別被開發為有效的瞬時和穩定表達系統。方法原理是使用脂質體、磷酸鈣或PEG作為轉染試劑瞬時轉染HEK293細胞。雖然瞬態表達相對容易和簡單,但擴大規模卻在技術上存在挑戰性。CHO細胞通常用於穩定表達大量重組蛋白。
圖2 哺乳動物表達系統細胞分類
表達載體通常可以選擇:pcDNA 3.1,pIRES,pTT3,pCEP4,pATX1等常規載體;或者艾柏森公司分子技術人員自行合成與後期改造的專利性載體。
哺乳動物表達系統實例表達蛋白信息:
生物細胞器基質蛋白,全長334aa,重37.03kDa,含有Fc標籤蛋白,使用293F細胞表達。
第一步,在編碼基因全密碼子優化後,以pTT3載體構建質粒,測序驗證後,進行30mL測試表達:圖3 測試表達SDS—PAGE第二步,為了獲得目標蛋白的最大回收率,對流過的蛋白G進行了兩次純化,在第二次純化後可以觀察到FT中剩餘的目標蛋白。
圖4 目標蛋白第一次純化譜
圖5 目標蛋白第二次純化譜
第三步,為優化蛋白表達效率,我們提高了鹽濃度至300mM NaCl,洗脫後FT中剩餘的蛋白量顯著降低。
圖6 目標蛋白優化條件後表達譜
第四步,實驗條件優化成功,採用2L發酵法進行大規模表達。
圖7 目標蛋白純化圖譜及QC凝膠
看到這麼優秀的實驗結果,多步驟優化最終取得完美的表達效率,您心動了嗎?能穩定表達大量正確摺疊蛋白的細胞系,再加穩定的高表達載體,這樣的哺乳動物表達系統簡直能直接保證實驗結果!艾柏森公司來幫您的實驗省時省力~蛋白表達系統系列服務周期只需要8~10周!更有成熟的細胞系抗體等系列產品購買通道——產品購買請點此處:
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圖9 服務流程示意圖