撰文 | 鹹姐
責編 | 兮
煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其還原形式（NADH）在維持幾乎所有生物的細胞代謝和細胞存活中起著至關重要作用。NAD+作為電子受體，在脂肪酸氧化、三羧酸循環等不同代謝途徑之間傳遞能量，同時，NAD+是糖酵解和線粒體呼吸過程中所必須的，NAD+的缺乏將無法產生ATP。此外，當釋放到細胞外環境時，NAD+也是多種信號酶的底物，包括去乙醯化酶（sirtuins）、ADP核糖轉移酶和循環ADP核糖合成酶等，可以調節各種細胞信號通路【1,2】。毫不誇張地說，細胞內NAD+含量的細微變化就會影響細胞的行為，而完全的缺乏則是致命的。
線粒體中NAD+的含量對於維持重要的細胞功能尤其重要，百年來針對NAD+的研究有一大部分都集中在線粒體基質中的NAD+依賴過程。儘管研究發現一些真菌和植物中的線粒體NAD+是通過載體蛋白從細胞質導入的，但是這些轉運體在哺乳動物中都沒有同源物，介導NAD+進入哺乳動物線粒體的轉運體至今尚未發現，哺乳動物線粒體到底是如何獲得其所需的NAD+的量的問題從未得到過解答。雖然研究發現線粒體煙醯胺單核苷酸腺苷轉移酶（NMNAT3）可以在體外催化NAD+的生物合成，也有研究表明線粒體內可能擁有一個完整的通路促進煙醯胺直接合成NAD+，但是研究證實這並不是哺乳動物線粒體NAD+來源的普遍機制【3,4】。似乎哺乳動物的線粒體也存在著某種轉運體，可以將胞質中的NAD+運輸進線粒體，但是是誰肩負著這一重任呢？
2020年9月9日，來自美國賓夕法尼亞大學的Joseph A. Baur團隊在Nature上在線發表文章「SLC25A51 is a mammalian mitochondrial NAD+transporter」，首次發現哺乳動物細胞中肩負著線粒體中完整NAD+轉運重任的轉運蛋白——SLC25A51。
故事的開始似乎並不複雜。作為線粒體載體家族的一員，SLC25A51早已被多個全基因組篩選研究確定為一個必需基因，但是卻一直沒有人賦予其功能，因此，成為本文研究人員的候選基因。
首先，第一個問題在於SLC25A51是否在線粒體NAD+穩態中發揮作用呢？研究人員利用多個不同的shRNA和siRNA序列在人類細胞系中進行敲低實驗，或用CRISPR敲除細胞中的SLC25A51，都發現SLC25A51對於維持線粒體NAD+的水平是必須，但是不影響細胞內的NAD+總量。
而過表達SLC25A51則足以增加線粒體內游離NAD+的水平，與過表達酵母線粒體NAD+轉運體NDT1所產生的影響類似。利用兩種不同的線粒體靶向NAD+生物傳感器也能檢測出同樣的結果。與此同時，代謝組學分析顯示，線粒體提取物中只有NAD+、NADH和NAD+衍生代謝物循環ADP核糖發生了顯著變化，相比之下，整體細胞提取物中的NAD+和NADH水平並沒有變化。由此證實，SLC25A51的缺失將導致線粒體組分中NAD+的選擇性缺失。
進一步的實驗發現，SLC25A51缺陷或缺失的細胞中，其線粒體的基礎呼吸和最大呼吸能力，以及依賴於複合體Ⅰ的呼吸都受損。這種情況下，簡單的補充內源性NAD+並不足以挽救細胞的線粒體呼吸，只有低劑量的腺病毒感染以限量過表達SLC25A51時才能使其恢復。但與呼吸能力相比，線粒體膜電位在SLC25A51缺失後保持不變。可見SLC25A51的表達對於細胞呼吸有著深遠的影響。
那麼，SLC25A51是否介導了哺乳動物線粒體對NAD+的攝取呢？當把提取分離出來的線粒體與內源性NAD+一起孵育時，正常細胞的線粒體基質中的NAD+含量增加，但是SLC25A51缺陷細胞的線粒體基質中的NAD+含量沒有變化，只有在重新表達了SLC25A51後線粒體才恢復對內源性NAD+的攝取。同樣的，過表達SLC25A51足以增加分離線粒體對內源性NAD+的攝取。
此外，研究人員發現，酵母線粒體NAD+轉運體NDT1也可以挽救SLC25A51缺陷細胞的線粒體NAD+的重新攝取。同樣的，SLC25A51的過表達可以使缺失了內源性NAD+轉運蛋白的酵母線粒體恢復對NAD+的攝取。由此表明線粒體攝取NAD+的能力依賴於SLC25A51或具有NAD+轉運蛋白活性的蛋白的表達。
為了進一步研究SLC25A51介導完整細胞內線粒體NAD+轉運的能力，研究人員利用了一種線粒體靶向聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（mitoPARPcd）載體，該報告系統基於線粒體NAD+的持續消耗及其對聚ADP核糖（PAR）自我修飾的偏好，PAR的穩態水平可以反映線粒體攝取NAD+的能力。結果表明，過表達SLC25A51可以顯著提高mitoPARPcd報告系統的信號。
同樣地，由於煙酸核苷（NaR）可以通過胞質酶NAD+合成酶轉化為NAD+，研究人員用同位素標記煙酸和核糖以監測胞漿中合成的NAD+含量，結果發現NaR可以增加野生型細胞中線粒體內NAD+的含量，但對SLC25A51缺失細胞則無影響；在兩類細胞中，整體細胞內NAD+的標記程度類似，但大部分標記的NAD+只在野生型細胞中進入了線粒體，而SLC25A51缺失細胞中沒有進入。
綜上所述，本文首次發現SLC25A51及其同源物SLC25A52可以介導哺乳動物線粒體對NAD+的攝取，並且證實SLC25A51是維持人類細胞中正常線粒體NAD+水平所必需的。儘管目前尚不能排除線粒體NAD+攝取的其他可能機制，但是SLC25A51在多個細胞系中的特徵表明，直接由SLC25A51介導的攝取是哺乳動物線粒體NAD+攝取的主要機制。
參考文獻：
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