宏基因組生信分析方法

2021-02-20 APExBIO

上節簡單跟大家講解了宏基因組的實驗過程（點擊關於宏基因組學的實驗操作進行複習），當我們拿到測序數據後，就該考慮如何進行下一步的分析了，今天我們就來看一下宏基因組數據生信分析的基本流程。

宏基因組的分析策略主要分為：

（1）基於拼接的分析；

（2）不基於拼接的分析。

又可以分為：

（1）物種注釋分析；（2）功能注釋分析；（3）差異物種分析；（4）差異基因分析。

可構建多物種基因組，但只有達到足夠覆蓋度的物種才能被較好地組裝。低豐度菌株信息容易被丟掉，因而reads利用率低

可提供多物種功能、結構信息，但局限於資料庫提供的已知信息，且在mapping時可能產生誤判

只要資料庫內容足夠、測序量足夠，可以有效地分析大多數複雜群落

基因組組裝需要經驗與技巧，還需要其它實驗驗證或輔助填gap

1. 測序數據質控，2. 過濾和去宿主，3. 數據組裝，4. 基因預測，5. 物種注釋，6. 功能注釋。

HUMAnN2 (The HMP Unified Metabolic Analysis Network 2) 是基於宏基因組、宏轉錄組數據分析微生物通路豐度的有效工具。這一過程稱為功能譜，目的是描述群體成員的代謝潛能。可以回答微生物群體成員可以幹什麼，或在幹什麼的問題。

軟體特點

1. 可對已知和末知生物分析群體功能譜

2. 可獲得基因組、基因和通路層面的結果

UniRef資料庫提供基因家族的定義

MetaCyc提供基因通路的定義

MinPath提供定義的最小通路集

3. 簡單的使用界面（單行命令工作流）

4. 加速序列比對

採用Bowtie2加速核酸水平搜索

採用Diamond加速翻譯蛋白水平搜索

1conda install humann2
2~/conda/bin/humann2_databases --download chocophlan full /data/humann2
3~/conda/bin/humann2_databases --download uniref uniref90_diamond /data/humann2
4wget http://github.com/bbuchfink/diamond/releases/download/v0.9.21/diamond-linux64.tar.gz
5tar xzf diamond-linux64.tar.gz
6sudo ln -fs `pwd`/diamond /usr/local/bin/
7##運行humann2
8## $SAMPLE為宏基因組測序過濾後的數據，可以是fastq,fastq.gz格式。
9## $OUTPUT_DIR為輸出文件夾輸出文件包括：
10## $OUTPUT_DIR/$SAMPLENAME_genefamilies.tsv*
11## $OUTPUT_DIR/$SAMPLENAME_pathcoverage.tsv
12## $OUTPUT_DIR/$SAMPLENAME_pathabundance.tsv

https://huttenhower.sph.harvard.edu/humannhumann2 –input $SAMPLE –output $OUTPUT_DIR 宏基因組研究中，你想不想知道哪些序列來自哪些菌，想不想拼出末培養菌或末知菌的基因組呢？其實這些可以有，很多高水平文章中都有，這個過程就叫Binning（我習慣將其翻譯為分箱），是宏基因組分析提升檔次的關鍵步驟。即通過binning得到的bins (strain-level clusters / strain-level taxonomic units) 可以進行宏基因組關聯分析以及多組學聯合分析，將特定功能代謝產物與特定物種、特定基因進行關聯研究，推動其因果機制的探究，為疾病監控、環境監測提供了菌株水平的生物靶標。通過對binning得到的bins進行後續組裝，可以得到很多不能在實驗室裡培養的細菌、古菌或病毒的基因組草圖，然後根據單菌組裝結果進行菌株水平的基因和功能注釋、比較基因組分析、進化分析等，使我們得以洞察菌株的生態適應、營養互作和新陳代謝等，研究在生態環境和複雜疾病中作用的菌種以及致病菌和宿主的互作機制及其微進化機制。分箱一般在基因組組裝之後進行，有許多工具可進行分箱。跟大家介紹兩個易用且高引的軟體——MaxBin和MetaBAT。為了進行分箱，我們先要使用bwa比對原始序列到拼接結果，估計疊連群的相對豐度。對於分箱的結果，我們要使用VizBin進行檢查。

1curl https://downloads.jbei.org/data/microbial_communities/MaxBin/getfile.php?MaxBin-2.2.2.tar.gz > MaxBin-2.2.2.tar.gz
2tar xzvf MaxBin-2.2.2.tar.gz
3cd MaxBin-2.2.2/src
4make

1curl -L https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/downloads/metabat-static-binary-linux-x64_v0.32.4.tar.gz > metabatv0.32.4.tar.gz
2tar xvf metabatv0.32.4.tar.gz

Maxbin考慮每個contig的序列覆蓋度和四鹼基頻率，以記錄每個bin的標誌基因數量。

1run_MaxBin.pl -contig subset_assembly.fa -abund_list abundance.list -max_iteration 5 -out mbin

此步驟會產生一系列文件。會發現產生一系列*.fasta的按數字排列的文件，這些就是預測的基因組bins。MetaBAT分箱考慮三點：測序reads覆蓋度 (read coverage)、覆蓋度變異 (coverage variance)、和四鹼基頻率 (tetranucleotide frequencies)。

1metabat/metabat -i subset_assembly.fa -a depth_var.txt --verysensitive -o metabat -v > log.txt

## 可對binning進行可視化用CheckM軟體

1pip install checkm-genome
2wget https://data.ace.uq.edu.au/public/CheckM_databases/checkm_data_v1.0.7.tar.gz
3checkm test ~/checkm_test_results
4#Run
5checkm lineage_wf -t 8 -x .genome.fa input_File output_File

## 處理基因中的胺基酸文件時，使用擴展名為faa的文件

1checkm lineage_wf --genes -t 8 -x faa <bin folder> <output folder>

1. 數據質量評估

1fastqc fastq1.gz
2fastqc fastq2.gz
3##質控後可以查看結果,將數據轉到桌面檢查
4Sz fastqc1/fastqc_report.html
5Sz fastqc2/fastqc_report.html

2. 質控數據的處理

1java -jar /opt/biosoft/Trimmomatic-0.30/trimmomatic-0.30.jar PE -threads 20 -phred33 fastq1.gz fastq2.gz clean.fastq1.gz unpaired.fastq1.gz clean.fastq2.gz unpaired.fastq2.gz 
2ILLUMINACLIP:/opt/biosoft/Trimmomatic-0.30/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
3LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50
4##再用FASTQC查看過濾後的結果，步驟同上
5##MultiQC
6#在工作目錄中的未修剪和修剪文件上運行Mulitqc：
7Multiqc ./

3. Metahit組裝宏基因組

MEGAHIT是一款非常快速，非常好的組裝程序，專為宏基因組而設計。

1##安裝
2git clone https://github.com/voutcn/megahit.git
3make
4##運行megahit
5~/megahit/megahit --12 clean.fastq1.gz, clean.fastq2.gz -o combined
6##運行QUAST
7~/quast/quast.py combined/final.contigs.fa -o combined-report

到這一步，我們就已經完成了宏基因組數據分析的基礎步驟，可以開始進行後續的數據分析，這個分析是多種多樣的，可以根據研究方向的需求進行調整。4. 宏基因組拼接以後，接下來常用的分析就是分箱 (binning)，即將組裝的疊連群 (contigs) 進行分組或分箱，這些組內可能來自相近的分類學單元。5. 宏基因組基因預測 ——MetaGeneMark，Prokka## 下載：http://topaz.gatech.edu/GeneMark/license_download.cgi

1##基於單個樣本的基因預測
2gmhmmp -a -d -f G -m MetaGeneMark_v1.modsample1.cut500.scafSeq -A sample1_protein.fasta -D sample1_nucleotide.fasta
3##基於混合組裝的基因預測
4gmhmmp -a -d -f G -m MetaGeneMark_v1.modmix.cut500.scafSeq -A mix_protein.fasta -D mix_nucleotide.fasta

-m 用於基因預測的模型文件，MetaGeneMark提供的MetaGeneMark_v1.mod適用於宏基因組預測

1prokka assembly.fa --outdir prokka.annotation --prefix metagG –metagenome

該命令會產生prokka.annotation文件夾，其中包含一系列文件。可採用基於reads的Metaphlan2軟體進行物種注釋Anvi'o是一款非常強大且可擴展的工具箱，主要用於泛基因組分析，也同樣適用於宏基因組分析。

1conda create -n anvio232 -c bioconda -c conda-forge gsl anvio=2.3.2
2source activate anvio232

https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/anvio.html好啦！今天關於宏基因組的分析部分就介紹完啦，歡迎大家諮詢我們的技術人員~

···

最後：

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