生物緩衝液能在加入少量酸或鹼時穩定緩衝系統的pH值,這對創造正常的生理環境起很重要的作用,因為多數細胞僅能在很窄的pH範圍內進行活動,而且需要有緩衝體系來抵抗在代謝過程中出現的pH變化.在生化研究工作中,常常要用到緩衝溶液來維持實驗體系的酸鹼度.研究工作的溶液體系pH值的變化往往直接影響到我們工作的成效.如果提取酶實驗體系的pH值變化或變化過大,會使酶活性下降甚至完全失活.所以我們要學會配製緩衝液.
TRIS作為常用生物緩衝液的一種,常用於生物化學實驗中的TAE和TBE緩衝液(用於核酸的溶解),其氨基可以與醛發生縮合反應。Tris為弱鹼,Tris鹼的水溶液pH在10.5左右,一般加入鹽酸以調節pH值至所需值,即可獲得該pH值的緩衝液,其緩衝液的有效緩衝範圍在pH7.0到9.2之間,但應注意溫度對於Tris的pKa的影響,在室溫25℃下,pKa為8.1。
Tris緩衝液配置方法:
Tris-HCl,Tris-EDTA的配製:
一、1M Tris-HCl (pH 7.4,7.6,8.0) 配製1000ml
配製方法:
1.稱量121.1g Tris置於1000ml燒杯中。
2.加入約800ml的去離子水,充分攪拌溶解。
3.按下表加入濃HCl量調節所需要的pH值。
4.將溶液定容至1000ml。
5.高溫高壓滅菌後,室溫保存。
注意:應使溶液冷卻至室溫後再調定pH值,因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大,溫度每升高1℃,溶液的pH值大約降低0.03個單位。
二、1.5M Tris-HCl (pH 8.8)配製1000ml
配製方法:
1.稱量181.7g Tris置於1000ml燒杯中。
2.加入約800ml的去離子水,充分攪拌溶解。
3.用濃HCl調節pH值至8.8。
4.將溶液定容至1000ml。
5.高溫高壓滅菌後,室溫保存。
注意:應使溶液冷卻至室溫後再調定pH值,因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大,溫度每升高1℃,溶液的pH值大約降低0.03個單位。
三、TE即Tris-EDTA buffer(10mM Tris,1mM EDTA,pH7.4 pH7.6 pH8.0)。
10×TE Buffer (pH 7.4,7.6,8.0) 100mM Tris-HCl,10 mM EDTA 配製1000ml
配製方法:
1. 量取下列溶液,置於1000ml燒杯中。
①1M Tris-HCl Buffer(pH7.4,7.6,8.0) 100ml;
②500mM EDTA(pH8.0) 20ml
2.向燒杯中加入約800ml的去離子水,均勻混合。
3.將溶液定容至1000ml後,高溫高壓滅菌。
4.室溫保存。
注意事項:
1、緩衝液的pH值受溶液濃度影響較大,緩衝液稀釋十倍,pH值的變化大於0.1;
2、 溫度效應大,溫度變化對緩衝液pH值的影響很大,△pKa/℃=-0.031,例如:4℃時緩衝液的pH=8.4,則37℃時的pH=7.4,所以一定要在使用溫度下進行配製,室溫下配製的Tris-HCl緩衝液不能用於0℃~4℃;
3、 易吸收空氣中的CO2,所以配製的緩衝液要蓋嚴密封;
4、 此緩衝液對某些pH電極發生一定的幹擾作用,所以要使用與Tris溶液具有兼容性的電極。