在確立了五弦的絕對音高后，就可以此為基準，根據各弦的相對音高調準其它六弦。前文已經說明，古琴既可以按純律定弦，也可以按五度相生律定弦，而大多數情況下都是按五度相生律定弦的。下面就分別以兩種律制的定音調弦方法作對比敘述。
很多教材中都提到，古琴定音調弦可以有散音法、按音法和泛音法以及散按結合法、散按泛結合法等多種。然而對於大多數業餘琴友來說，散音法基於對音程關係的聽辨能力，按音法基於對按弦取音位置的準確性，皆不易準確掌握；最準確而又易於掌握的方法還是泛音法，即便觸弦取音的位置略有偏差，仍能發出準確的泛音。因此這裡僅以泛音法作講述，至於散音法、按音法等，可以作為泛音法定弦後的校驗方法，本文不作贅述。
（1）純律定弦法（一般很少採用）
定弦步驟如下（以下徽位均指泛音）：
①定五弦：通過定音器或校音器定五弦為標準音
②定七弦：五弦四徽 → 七弦五徽
③定六弦：五弦二徽 → 六弦三徽
④定四弦：六弦五徽 → 四弦四徽
⑤定三弦：六弦七徽 → 三弦五徽 或：六弦四徽 → 三弦二徽
⑥定二弦：五弦七徽 → 二弦五徽 或：五弦四徽 → 二弦二徽
⑦定一弦：四弦七徽 → 一弦五徽 或：四弦四徽 → 一弦二徽（至此步驟定弦完畢）
⑧校一三弦：一弦四徽 → 三弦五徽（校驗）
⑨校二三五弦：二弦二徽 → 三弦三徽 → 五弦四徽（校驗）
純律定弦完畢後，在彈奏時可以發現，除了純四度、純五度這樣的和諧音程外，還存在一些特殊的音程和音差。例如一四弦、二五弦、三六弦之間的散音音程均為純五度，而四七弦之間為窄五度，比純五度「窄」22個音分，這個22音分的音差稱為普通音差。再如一三弦、四六弦、五七弦之間的散音音程均為純四度，而二四弦之間為寬四度，比純四度「寬」一個普通音差。
在泛音中同樣存在類似的音差。如四弦五徽（九徽）泛音比七弦七徽和二弦四徽（十徽）泛音高一個普通音差；四弦十二徽（二徽）泛音比二弦十三徽（一徽）泛音高一個普通音差。
（2）五度相生律定弦法（一般常用此法）
定弦步驟如下（以下徽位均指泛音）：
①定五弦：通過定音器或校音器定五弦為標準音
②定七弦：五弦四徽 → 七弦五徽
③定四弦：七弦七徽 → 四弦五徽 或：七弦四徽 → 四弦二徽
④定六弦：四弦四徽 → 六弦五徽
⑤定三弦：六弦七徽 → 三弦五徽 或：六弦四徽 → 三弦二徽
⑥定二弦：五弦七徽 → 二弦五徽 或：五弦四徽 → 二弦二徽
⑦定一弦：四弦七徽 → 一弦五徽 或：四弦四徽 → 一弦二徽（至此步驟定弦完畢）
⑧校一三弦：一弦四徽 → 三弦五徽（校驗）
⑨校二四弦：二弦四徽 → 四弦五徽（校驗）
五度相生律定弦完畢後，可以發現，其各弦散音間完全符合純四度、純五度的和諧音程，但在泛音中，還是存在一些特殊的音差。如三弦的三、六、八、十一徽泛音比五弦的四、十徽泛音低一個普通音差；六弦的三、六、八、十一徽泛音比五弦的二、十二徽泛音低一個普通音差；其實各弦的三、六、八、十一徽泛音均比五度相生律的標準音偏低一個普通音差。
（3）兩種律制定弦的差異
取兩張琴，分別按照上述純律和五度相生律定弦，通過彈奏比較即可發現，純律定弦的琴，其一、三、四、六弦音高均比五度相生律定弦的琴高一個普通音差（22音分），而二、五、七弦的音高在兩種律制定弦的琴上是相同的。
明白了各種律制間差異的原理，就不難理解為何有一些歷代流傳下來古琴譜彈奏起來似乎並不和諧，並不一定是因為傳抄的錯誤，而很可能是遵循不同律制的差異所致。