景傑編者按：哺乳動物的性染色體是從祖先的常染色體進化而來。在漫長的進化過程中，性染色體發生複雜變化。其中，雄性減數分裂過程中，經歷基因的轉移和重新分配，X染色體收穫了特殊技能。很多retrogenes（逆轉座基因）起源於X染色體，在基因組中所佔的比例遠遠高於起源於常染色體的比例。這些逆轉座基因從哪來？其生物學意義是什麼？正是研究人員一直想回答的問題。
早在2002年，芝加哥大學龍漫遠教授報導retrogenes偏向離開X染色體，轉移到常染色體中，他推測這種現象是對X染色體失活的補償效應【1】。目前認為這種現象和減數分裂性染色體沉默（Meiosis sex chromosome inactivation,MSCI）有關。MSCI的進化壓力驅動了X染色體上的基因逆轉座到常染色體上。但該假說一直在實驗上未能進行驗證。
日前，中國科學技術大學史慶華教授課題組在著名期刊Current Biology發表文章，在小鼠上驗證了15年前龍漫遠教授的推測。RPL10L是位於小鼠常染色體並在睪丸中特異表達的retrogene，它的前體是X染色體上一個核糖體蛋白編碼基因RPL10。通過和景傑生物合作，研究人員利用高通量定量蛋白質組學技術，分析了Rpl10I-/-和 Rpl10l+/+小鼠中核糖體蛋白的差異，證實Rpl10l能夠補償MSCI導致的Rpl10轉錄沉默以保證正常的精子發生，為基於MSCI的retrogenes補償假說提供了直接的實驗證據【2】。
除了retrogenes外，表觀遺傳修飾也是一種近期被關注的，解釋補償假說的理論。2010年，芝加哥大學趙英明教授在Cell上報導了一種全新的蛋白質翻譯後修飾：組蛋白巴豆醯化修飾，同時證明該修飾在突破X染色體基因抑制中發揮了重要的調控作用【3】，因此關於X染色體上基因補償假說，還有很多方向，尤其是組蛋白翻譯後修飾，值得研究人員關注。
關鍵詞：RPL10，RPL10L，逆轉座基因，性染色體沉默，補償假說
研究思路和成果：
研究人員利用CRISPR/Cas9的方法製備了Rpl10l敲除小鼠（Rpl10l+/-代表雜合突變，Rpl10l-/-代表純合突變），並外源導入Rpl10l補償內源敲除，利用螢光定量PCR、Western blot、免疫螢光染色、定量蛋白質組分析詳細研究它們的表達模式、分子功能及作用方式，以期深入了解X染色體來源的retrogenes存在的意義及其進化機制。
首先檢測了人和小鼠不同組織和細胞系中Rpl10l的表達，q-PCR和Western blot結果發現Rpl10lm-RNA和Rpl10l蛋白在人和小鼠睪丸中特異表達（圖1）。Rpl10l+/-雜合小鼠睪丸及附屬睪丸大小及精子數目與野生型小鼠沒有顯著性差異，但是Rpl10l-/-敲除小鼠睪丸形態和體重明細減少，且附睪中沒有精子，組織切片染色結果一致（圖1）。表明Rpl10l敲除導致小鼠精子發生失敗且喪失生育能力。
圖1.
RPL10L在小鼠睪丸中特異表達且與精子發育相關。和野生型相比，Rpl10l-/-小鼠睪丸發育異常
研究人員發現Rpl10l敲除導致了第一次減數分裂停滯（圖2A），為了檢測敲除小鼠中精子發生停滯的具體時期，作者對精母細胞前期Ｉ進程進行分析，發現Rpl10l敲除不影響精子發育過程中精母細胞前期I的進程（圖2BC）。隨後，對精母細胞前期I向中期I的轉換染色和計數分析（圖2C,D），發現統計結果顯示與Rpl10l+/-小鼠睪丸細胞相比，敲除小鼠睪丸細胞滴片上沒有發現MMＩＩ細胞,且只有少量MMＩ細胞，Rpl10l敲除會導致精母細胞前期Ｉ向中期Ｉ的轉換失敗。
圖2.Rpl10l敲除導致第一次減數分裂失敗
為了探索究竟Rpl10l突變是如何導致精子發生失敗，研究人員和景傑生物合作，利用其高通量定量蛋白質組學平臺，對粗線期和雙線期的Rpl10l+/+和Rpl10l-/-細胞全蛋白組進行TMT定量分析。定量到3100個蛋白，敲除後細胞樣本中1.3倍上調蛋白368個，對應下調蛋白445個。進一步對核糖體進行分析發現發現69個核糖體蛋白被定量，其在敲除中67個蛋白在Rpl10l-/-敲除鼠粗線期和雙線期精母細胞中含量降低，且30個降低倍數超過1.3倍（圖3），並且Western blot證實相關核糖體蛋白含量變化（圖3）。結合蛋白組學結果，可以說明Rpl10l蛋白對小鼠粗線期及雙線期精母細胞中的核糖體生成至關重要，它的缺失將導致細胞中核糖體數目下降，進而導致細胞內大量蛋白的變化並致使減數分裂進程受阻和精子發生失敗。
圖 3. Rpl10l-/-敲除鼠中核糖體蛋白顯著下調
左圖，定量蛋白組堅定到的下調的核糖體蛋白
右圖，Western實驗的驗證
接下來作者通過一系列實驗驗證了Rpl10在減數分裂性染色體失活過程中發生轉錄沉默，通過敲低Rpl10的mRNA水平進一步發現Rpl10敲低會破壞細胞中核糖體生成，並導致Ｇ１期細胞周期停滯。這與Rpl10l敲除鼠在粗線期和雙線期精母細胞中結果一致。
根據補償學說，Rpl10l應該會在Rpl10轉錄沉默的細胞中特異表達。作者巧妙的設計了一個補救實驗，實驗組將EGFP、Rpl10-EGFP、Rpl10l-EGFP表達載體與靶向RPL10的CRISPR/Cas9共轉染，而對照組則是與無義的Rpl10-EGFP共轉染。結果表明293T細胞系中導入外源Rpl10l蛋白能夠替代內源Rpl10蛋白，維持細胞正常增殖和存活（圖4），意味著他們具有相同的並且可以替換的分子功能。
圖4.外源Rpl10l補償了Rpl10在精子發生中的轉錄沉默
那麼，這是否意味著Rpl10同樣能挽救RPL10L敲除小鼠的精子發生和生育力？
作者成功構建了Rpl10轉基因的RPL10ll敲除小鼠，雄性Rpl10-mCherryTG小鼠與雌性敲除小鼠進行雜交的2代小鼠進行試驗，結果如圖5，結果充分說明Rpl10-mCherryTG轉基因小鼠可以重建Rpl10l敲除小鼠的精子發生和生育力。
圖5.Rpl10轉基因部分補救pl10l敲除小鼠的精子發育和生育力
總結：作者通過構建Rpl10l敲除小鼠發現RPL10L在小鼠睪丸中特異表達且與精子發育相關。利用高通量蛋白質組學分析進一步揭示Rpl10l缺失將導致細胞中核糖體數目下降，進而導致細胞內大量蛋白的變化並致使減數分裂進程受阻和精子發生失敗機制。通過細胞水平的回補實驗，證實外源Rpl10l蛋白能夠替代內源Rpl10蛋白維持細胞正常增殖和存活，補償了Rpl10在精子發生中的轉錄沉默。以此為依據構建了Rpl10轉基因的RPL10l敲除小鼠，證實可以重建Rpl10l敲除小鼠的精子發生和生育力。Rpl10l蛋白能夠補償MSCI過程導致的Rpl10蛋白的不足，以保證正常的精子發生，這也為Ｘ染色體起源的retrogenes補償假說提供了直接的實驗證據，並且支持MSCI是Ｘ染色體向常染色體上產生大量retrogenes的進化壓力。
於此同時，大量研究表明MSCI廣泛存在的表觀遺傳調控，如histone的醯化修飾、甲基化等修飾，因此組蛋白修飾在補償效應中的角色還有待研究人員去發掘。景傑生物作為全球蛋白質組學技術的領跑者，可以為您提供一整套常規蛋白質組學及修飾組學（磷酸化、乙醯化、巴豆醯化、琥珀醯化、二羥基異丁醯化、丙醯化、丁醯化、丙二醯化等）研究的解決方案，同時還能為您提供高靈敏度的修飾類泛抗體，助力您的研究工作，與您一起探索生命的奧秘。
參考文獻：
1.Esther Betran,et al.,(2017), Retroposed New Genes Out of the X inDrosophila,Genome Research12,1854-1859.
2.Long Jiang,et al.,(2017), RPL10L Is Required for Male Meiotic Division by Compensating for RPL10 during Meiotic Sex Chromosome Inactivation in Mice，Current Biology27,1-8.
3.Mingjia Tan,et al.,(2011),Identification of 67 HistoneMarks and Histone Lysine Crotonylation as a New Typeof Histone Modification.Cell146, 1016-1028.
通訊作者簡介：
史慶華博士，中國科學技術大學教授，博士生導師，合肥微尺度物質科學國家科學中心PI；中國科學院「百人計劃」引進人才；國家傑出青年基金獲得者；國家重大科學研究計劃項目「卵泡發育的分子調控」和國家重點研發計劃項目「人類配子發生、成熟障礙和胚胎停育的分子基礎」首席科學家；曾任科技部國家重大科學研究計劃專家組專家。
近10年來，以第一或通訊作者在Nature、American Journal of Human Genetics、Nucleic Acids Research、Bioinformatics、Cell Research和Current Biology等雜誌上發表SCI論文6餘篇，被他人引用2000餘次。
景傑生物通過整合以組學為導向（包括基因蛋白質組學和組蛋白密碼組學）的生物標誌物發現、以生物標誌物為導向的藥物研發、以高質量抗體為基礎的診斷試劑盒開發這三個環節，逐步構建起「疾病精準分層」、「精準藥物研發」、「疾病精準診斷」 三位一體的精準醫療產業化發展的運作鏈條，從而為精準醫療產業化開創出一片廣闊前景, 並開闢出一條可行路徑。