co-regulation of proteins in development and immunity
譯名：擬南芥蛋白質組圖譜的重塑與蛋白質在發育和免疫中共同調節通訊作者：Wolfgang Hoehenwarter1. 深度蛋白質組學研究方法
因為要對擬南幾種組織（組織分別為根，葉，莖生葉，莖，花和角果/種子以及7天至93天衰老的整株植物幼苗）的不同生命階段進行蛋白質組學測量，及測量用肽flg22處理PTI誘導的蛋白質組。研究者開發了一種能夠在合理的時間範圍內對植物進行深度採樣的方法。首先從組織蛋白提取開始，然後進行複雜提取物的多步分級分離。分離方法為4％SDS蛋白質提取和溶膠LC-MS，結合SDS-PAGE蛋白分離和反相（RP）LC肽分離與ESI MS。
植物細胞壁需要嚴格的破壞技術，含有大量的次生代謝產物，油脂和蠟，且綠色組織中含有色素，核糖二磷酸羧化酶（RuBisCo），都會導致質譜分析難度加大，不明顯信號受到抑制，檢測不到低豐度蛋白質。
SDS-PAGE提取有以下優勢：i）允許完全耗盡用於蛋白質提取的大量SDS。ii）在蛋白質下方的綠色低分子量帶中聚集的顏料和小分子有效地將蛋白質隔開。iii）RuBisCo的大亞基和小亞基（RBCL和RBCS）遷移到兩個突出的條帶，以利於它們與其餘蛋白質組分離。
將五個凝膠切片用胰蛋白酶進行凝膠消化，然後根據其成分的分子量分別注入LC-MS中。最豐富的植物蛋白（包括RBCL和RBCS）在葉和根中被分離成單個部分，從而減少了一過剩蛋白對肽和蛋白鑑定的抑制作用。由此鑑定出每個樣品5977至9524個蛋白質組。
2. 擬南芥蛋白質組鑑定結果
整個研究共鑑定和定量了15926個擬南芥蛋白質，其中15845個蛋白質編碼在核基因組中。核蛋白鑑定均勻分布在所有五個染色體上。用擬南芥發育研究中的蛋白質組學數據與轉錄組學數據進行了補充，後者使用微陣列測量了22157個核基因位點（包括1058個非蛋白質編碼基因）上的基因表達。此蛋白質組學數據為質譜提供了60％-70％擬南芥核基因組或更多轉錄組的同源蛋白質信息，包括1886個未鑑定到轉錄本或不在微陣列上的蛋白質（圖1 A和B）。
研究者還研究了阻礙擬南芥蛋白質組鑑定的原因。首先，缺失（未檢測到）的蛋白質在轉錄本豐度範圍內均勻分布（圖1 C），表明轉錄本豐度不是阻礙蛋白質檢測的主要因素。第二，有時會用基因的鹼基長度替代蛋白質長度，而缺失的蛋白質已明顯存在於檢測到的蛋白質的分布中較小的基因（圖1D），表明蛋白質大小是限制蛋白質檢測的一個因素。然後，研究者檢查了組織特異性蛋白質表達如何促進整個蛋白質組的累積表達（圖1 F）。儘管每個組織都以大斜率形成了累積的蛋白質表達曲線，但也可以看出，隨著樣品數量的增加，曲線收斂於飽和狀態。對於最後採樣的經flg22處理的組織，情況也是如此，在該組織中，可以預計在正常發育的組織中未檢測到大量免疫特異性蛋白的表達。這表明進一步採樣擬南芥不會大大增加整個蛋白質組的覆蓋範圍。
圖1 擬南芥蛋白質組的深度分析
A.將蛋白質表達映射到5個擬南芥核中染色體。從外到內的軌跡B. VENN圖顯示了同源轉錄本和蛋白質對蛋白質編碼基因的覆蓋率。C.轉錄物豐度與其相關蛋白的檢測之間的關係D。以bp為單位的蛋白質編碼基因大小與其相關蛋白質的檢測之間的關係E.GO分析。F.不同組織處理後累計鑑定蛋白質增加G.通過蛋白質組學方法確定的每個細胞所有已鑑定蛋白拷貝數。H擬南芥蛋白質組中PTM的整體研究。
研究者對葉組織中每個細胞15927種蛋白質進行了定量分析。將總的組蛋白MS信號等同於細胞DNA的質量，從而可以將PSM轉換為質量單位並計算總的細胞蛋白質量。然後可以將個體蛋白質與總蛋白質PSM的比率用於計算每個細胞的個體蛋白質拷貝數。計算得出的總細胞蛋白質質量為256.5 pg，來自細胞系與來自組織的量一致。蛋白質拷貝數的範圍從每個細胞略低於100到2.29e + 07，超過5個數量級（圖1G）。最豐富的蛋白質是RBCL，在葉片中具有4.73e +07個細胞拷貝。所有檢測到的小亞基的總拷貝數為5.4e + 07，因此大亞基與小亞基的比率為0.876，接近1：1的比率。對蛋白質的基因本體分析表明，最不豐富的蛋白質為核蛋白和轉錄調控因子，膜跨膜蛋白和激酶的豐度也較低。
蛋白翻譯後修飾（PTM）是蛋白功能的重要調節。使用深度蛋白質組學數據集，開放式搜索MS-Fragger算法對擬南芥中PTM進行研究。從超過1160萬個識別出350萬個PSM。在圖1 H中顯示了在至少一種組織類型或生理情況下，最豐富的PTM佔總PSM的0.1％以上。通過誘導的PTM，自然發生絲氨酸或蘇氨酸的磷酸化和N末端乙醯化修飾，影響約1.25％的總蛋白豐度。另外還檢測到形成肽鍵的轉肽反應，這是一種非翻譯機制。此外，蛋白質一級結構常見胺基酸置換。
3. 組織結構和發育蛋白質組學研究
研究者利用MS數據來研究擬南芥生命周期中各個組織的蛋白質組以及共同調節。首先，研究者將數據進行組織分組，合併了蓮座叢和莖生葉，進行了比較分析，每個蛋白質組包含約10,000種蛋白質。大約6,500種蛋白質在所有組織中無處不在，而每種組織都有500至600種蛋白質，葉除外，葉片顯示出將近1,000種獨特的蛋白質，這可能是由於大量聚集的葉子樣本所致（圖2A）。根中也缺少約1,000種蛋白質，但所有其他組織中都存在這種蛋白質，這反映了早生成地下組織生長特性。
PCA分析發現前兩個主要成分幾乎佔總方差的50％，說明前兩個主成分投影映了主要的數據結構（圖2 B）。各個組織蛋白質組明顯分開，只有花朵和花序莖在發育的同一時間（66天和73天）。更有趣的是，在所有採樣的組織都可以見到發育基因，說明蛋白質組在衰老過程中重塑。層次聚類分析（HCL）證實了PCA結果。
為了詳細研究在組織發育中蛋白質組的動力學與蛋白質共表達，採用一種抗噪性強的方法-稱Fuzzy c-means（模糊c均值）聚類。結果產生了16個集群，其中7個（分別為3、4、7、8、10、11、13），其蛋白質豐度具有有意義的生物學變化。
4. 根部蛋白質組學研究
屬於最大同一個集群的577種蛋白質是根部特異蛋白質，在任何其他發育階段的其他組織中都不豐富或不存在（集群3，圖2 C）。這些蛋白質的GO表明，它們中的許多都參與了與細胞外區域，金屬結合以及氧化和還原有關的過程。之前有關於磷酸鹽代謝文獻報導過這些蛋白質的表達，兩篇文章進行了比較，發現檢測到的根總蛋白中約有70％也存在於之前文獻。本研究中的兩項研究之間的7577種蛋白質相交，從而定義在根中最豐富的核心蛋白質組。
圖2 擬南芥的組織和發育特異性蛋白質組動態結構
A.擬南芥組織蛋白質組的定性比較。B.採樣組織的深度蛋白質組學測量的主成分分析（PCA）。C. FCM集群3顯示了僅在根部豐富的蛋白質。D. FCM集群7顯示在種子發育中大量增加的蛋白質，並且僅存在於種子或長角果中（PQI為原始PSM）。E. FCM集群4。右圖：基於STRING資料庫的酵母和人體研究同源性產生的物理蛋白質相互作用網絡。F. FCM集群13。
5. 種子蛋白質組學
集群7（圖2 D）包含的蛋白質豐度在種子中增加。其中許多是種子富含的貯藏蛋白，例如油質蛋白，白蛋白，十字花科素以及糖和脂肪酸代謝酶。也檢測並定量了許多調節種子發育的核心轉錄因子，磷酸酶和染色質修飾蛋白（圖2 D）。PP2C POL介導WUS/ WOX5基因表達，對於早期胚胎，PLL1分生組織的建立和幹細胞的維持至關重要。同樣，AIL轉錄因子BBM和HDG1具有拮抗作用，以平衡幹細胞的增殖和分化，AN3在PLETHORA1的上遊決定子葉身份。已知在種子發育中起重要作用的ABA信號蛋白在集群7中的信號強度不足，這是因為它們不僅不止在種子中積累，且在兩個測量階段（發育綠色和成熟的棕色角果）中都積累。LEC1（種子發育誘導物），AREB3和EEL（控制種子早期成熟的bZIP轉錄因子），在發育早期同樣高表達。同時在成熟種子檢測到ABI5與ABA信號阻遏物，與AFP1的比率均都大於1，表明了較高的ABA水平，可以誘導和維持了棕色角果樣品的種子休眠。誘導種子休眠所必需的DOG1蛋白和RDO5 PP2C，在成熟後種子蛋白質組中富集。許多其他PP2C蛋白也特別是在棕色長角果中積累了高水平的蛋白質。對於NAC轉錄因子進化枝其他成員也是如此，可能在種子發育和休眠中有潛在功能。
6. 核糖體蛋白的發育
集群4的315種蛋白質僅在幼根，幼莖和早期花/花蕾增加豐度較高，很多在花和花蕾隨著發育的進行減少（圖2 E）。多於半數蛋白質位於細胞核中，其中很大一部分與核仁和核糖體生物發生有關，含與WD40相互作用域，並且顯著富集。其中之一是LEUNIG（LUG），它是轉錄發育的共抑制因子和花發育的主要調控因子。
使用STRING分析顯示，集群4中18種與WD4之間存在潛在相互作用。UTP-B複合體的六個組成部分中的其中五個有組織和發育特異性表達（圖2 E的原始豐度值）。該複合物與EDA7（可能的核糖體生物發生因子）有相互作用。NuGWD1是一種糖誘導的WD40蛋白，SLOW WALKER 1（SWA1）是SSU複合體的組成部分，並且在擬南芥中也被證明與多個UTP-B成員相互作用。SWA1不是WD40蛋白，但它的表達模式和豐度與集群4蛋白的表達模式非常相似。PeBoW複合物（WD40蛋白質包含的複合物）表達在根，幼芽和早期花/花蕾中均升高。具有這種表達模式的核糖體蛋白與其他核糖體相關蛋白之間的物理相互作用很明顯。但是，集群4 RBF蛋白複合物表達模式保守得多。
另外分子伴侶在集群4蛋白中也高度顯著富集。
7. 膜囊泡運輸
一組153種蛋白質在根部富集，在衰老過程中增加，並在葉片中達到衰老的高峰，在由內花序莖和花中增加（集群13，圖2 F）。這些蛋白質與囊泡運輸，高爾基體和膜運輸有關。它們包含許多囊外複合體成員，SNARE和肌動蛋白等細胞骨架蛋白。囊泡運輸，細胞骨架重塑和組織是尖部生長細胞主要生理過程，在快速生長的組織（萌出的花序莖和花）中也很普遍。自噬在葉片和其他組織的衰老中起著重要作用。
8. 在光合作用的建立和維持中的蛋白質組
集群11和8幾乎全部是葉綠體定位，是重要光合作用蛋白。要存在於綠色組織中，包括幼嫩葉和莖生葉，在根和成熟的棕色角果中不存在這類蛋白質。集群11蛋白質的豐度在7和10天大的幼苗和莖生幼葉的子葉中達到高峰，並在衰老過程中下降，而集群8蛋白質在整個植物生命周期中始終是高表達的，在蓮座葉中有最大多於40天高表達衰老下降（圖3A和B）。
圖3 在光合作用的建立和維持以及光合作用裝置的降解和葉片衰老中的蛋白質組重塑
A. FCM群集11。B. FCM集群8。C. FCM集群10。
集群11中的蛋白質主要在葉綠體生物發生和功能性光合作用機制的建立中起作用（圖3 A），其他集群蛋白是類胡蘿蔔素合成中的相互作用伴侶。大約有30種集群蛋白為葉綠體特異性核糖體蛋白或與翻譯有關，其中許多基因敲除突變體具有胚胎致死表型。CPN60和CPN10形成了一個相互作用體集群。對於葉綠體的生物發生至關重要，而組成Toc / Tic複合物的集群組分已知在年輕幼苗中表達最強。形成葉綠體內部分裂環的兩個蛋白FtsZ1和FtsZ2也是集群成員。DAVID GO將集群蛋白定位到幾個質體結構上，由此推測它們定位在葉綠體。
集群8主要包含在成熟葉綠體中普遍存在的與光合作用直接相關的蛋白質（圖3 B），電子轉移Cytb6f複合物和類囊體ATP合酶CF1的成分也在這個集群內。幾乎Calvin-Benson循環的所有組成部分，以及與光呼吸有關的蛋白質都注釋為功能相關分子伴侶（圖3 B）。GO分析中的基質和碳代謝，類囊體和光合作用蛋白質組生成的的相互作用網絡具有特異性，並顯示出廣泛的重疊，證明了從葉綠體提取蛋白質的質量很高。
9. 衰老中的蛋白質組
集群10包含241種蛋白質，其豐度在植物生命過程中大幅增加，並在葉片和花朵衰老和果實成熟期間達到高峰。它們在年輕組織中並不豐富（圖3 C）。
衰老是一種受控的發育過程，需要分解葉片，進行養分轉移和資源分配，使花瓣衰落。研究發現了許多參與葉綠素和類胡蘿蔔素降解的蛋白質，其中包括一種分解螢光葉綠素的關鍵酶。研究表明，非螢光二氧雜環丁烷型葉（NDCC）代表了葉綠素分解代謝的主要終產物，而NCC的細胞色素P450單加氧酶CYP89A9負責葉綠素積累。該蛋白與其他13種CYP的為集群成員。
衰老過程中會產生大量的ROS，必須清除以免導致組織損傷和細胞過早死亡。許多集群蛋白都參與了氧化還原過程和ROS清除，包括至關重要的胞質抗壞血酸過氧化物酶APX6。更有趣的是，一組重要的集群蛋白是激酶，其中六個（CRK7，CRK8，CRK10，CRK14，CRK21，CRK41）是富含半胱氨酸的受體樣激酶（CRK）。ROS可能在信號傳導中發揮重要作用，介導衰老過程中的基因重編程。CRK半胱氨酸硫醇基可能對氧化還原狀態敏感，這些蛋白質可能在衰老中作為ROS傳感器和ROS信號引發劑，具體機制未知。
受精後花器官的脫落是另一個重要衰老過程，典型的脫落信號傳導模塊的蛋白質在花和角果中累積（圖3 C右圖）。有趣的是，它們的豐度在葉片和莖生葉中也增加，葉片脫落沒有固定時間，該脫落信號模塊的功能未知。
10. 穩態中的蛋白質組重塑PTI
研究者進一步分析蛋白質組結構的快速變化，例如由從正常生長到免疫的穩態轉變。將在液體培養中生長的7天和10天大的幼苗在培養基中以1 µMflg22處理16小時。Flg22是鞭毛蛋白N末端的22個胺基酸，可引發模式觸發的免疫（PTI）。共鑑定出8344種蛋白質。HCL顯示由於flg22處理，1774種蛋白質的豐度增加， 915種蛋白質的豐度降低。
通過使用MapMan軟體將這些蛋白質進行分類，大多數為受體，信號傳導和反應途徑中蛋白質組重塑。flg22受體複合物的動力學定量顯示，由於內化和降解導致FLS2豐度降低。囊泡運輸和轉運蛋白（包括囊泡和SNARE複合體成員）以及與早期呼吸爆發有關的蛋白（RBOHD）的含量增加。MAPK信號級聯的組分豐度也略有增加。PTI信號所必需的鈣依賴性蛋白激酶（CDPK），CPK 4、5和6，以及許多其他CDPK，鈣調蛋（CAM）和CAM結合蛋白和鈣調神經磷酸酶也略增加。有趣的是，幾種蛋白質在PAMP被定位到植物免疫途徑，例如效應觸發免疫（ETI）和程序性細胞死亡（PCD）和系統獲得性抗性（SAR），刺激後表現出豐度的變化。
圖4 PTI中植物激素活性的蛋白質組學模型
該圖顯示了在茉莉酸酯（藍色），色氨酸和IAA（綠色），次級防禦化合物/吲哚芥子油苷（紅色）的生物合成途徑以及IAA和JA信號傳導途徑（紫色）中定量的蛋白質。測量的蛋白質名字為黑色，蛋白質名稱旁邊的條形圖表示flg22處理后豐度的相對變化；數值是經過flg22處理的樣品中z分數轉化的原始#PSM的總和。未檢測到蛋白質為灰色。紅色核苷酸序列表示同源基因啟動子區域中的ARF1結合位點，藍色表示MYC2結合位點。實心箭頭表示生化途徑中的直接功能相互作用或緊鄰的步驟。虛線箭頭表示更多的遠端相互作用。
研究者從進一步研究PTI中植物激素活性的蛋白質組模型（圖4），在flg22處理16小時後，測量了植物激素，胺基酸和次生代謝產物。此外，基於時間的平行反應監測（PRM）的靶向蛋白質組學研究，對10天大擬南芥幼苗的三個樣品池中的16小時flg22處理蛋白的倍數變化進行準確定量統計（圖5）。PRM估算值與深度蛋白質組學定量分析完全吻合。
MapMan軟體分析可得，在光合作用中起作用的43種蛋白質的豐度略有下降，其中15個屬於光合作用的光反應，其中6個屬於光系統II。其他蛋白質參與了碳反應-卡爾文-本森循環，在PRM研究中顯示較小但顯著的倍數變化，這些蛋白質相對豐度較小。這些結果表明，光合作用在PAMP觸發時受到抑制，而在PTI中則相反。
flg22處理後，在植物初級代謝（尤其是碳水化合物代謝）中起作用的93種蛋白質的豐度增加。22個與糖酵解有關，19個與TCA周期有關，和6個與主要的CHO代謝有關。在PRM研究中，豐度的增加比光合作用相關蛋白的下調更明顯。
圖5 PRM的模型蛋白定量
11. 茉莉酸和水楊酸的交互網絡
16小時處理的flg22導致水楊酸（SA）合成途徑蛋白（ICS1）以及上遊轉錄因子TCP8，TCP22，NTM1-Like9（NTL9）的豐度增加，游離SA水平增加3倍。JA（茉莉酸）和JA-Ile生物活性綴合物絕對水平變化很小。同時，OPDA的水平升高了4倍以上，ACC豐度增加了5倍以上。OPDA是一種主要的JA前體。ACC是一種乙烯前體。
JA生物合成途徑中所有成分的蛋白質含量均升高，在PRM研究中得到證實。此外，核心JA受體複合物/信號蛋白COI1，TPR1至3和S相激酶相關蛋白1（SKP1）和CULLIN 1（CUL1）蛋白均顯著增加。大量的參與植物激素，特別是JA、IAA活性調節的酶在暴露於PAMP後顯著增加。flg22誘導的PTI優先誘導SA信號，非JA信號傳導。JA合成和信號途徑蛋白質豐度很高可能導致解偶聯作用，且因為低水平的JA和JA-Ile本身，表明植物激素共軛可能在這種情況下起關鍵作用。
12. 生長素/IAA動態平衡
對許多與生長素/IAA結合的GH蛋白以及其他蛋白的檢測來了解生長素在PTI中的作用。在flg22處理後，GH3.14，GH3.15和GH3.17的水平增加。GH3.14未顯示任何重要的序列同源性，表明PTI中的功能未知。生長素/ IAA通過色氨酸途徑合成，合成途徑中所有蛋白質的豐度均顯著提高，並且在PAMP處理16小時後色氨酸水平也升高了近2倍。
色氨酸途徑激發與防禦相關的次級代謝產物合成途徑有關，尤其是吲哚芥子油苷（IGs）度都大大增加。IG本身水平，I3M，1MOI3M，4MOI3M都沒有明顯變化，推測它們被PEN2水解。研究者鑑定了可能與生長素/IAA合成途徑有關的幾種蛋白質豐度明顯升高，然而生長素/ IAA水平略有下降。儘管生長素/ IAA的水平也沒有實質性變化，但極性生長素轉運蛋白的豐度卻受到顯著影響。PIN-FORMED 3（PIN3），PIN3在橫向根部生長和向性有作用，豐度明顯降低了2倍。影響側根生長的（PIN7）明顯減少。AUXIN RESISTANT 4（AXR4）蛋白，專門負責流入載體AUXIN RESISTANT 1（AUX1）略有提高。PIN3，PIN7和AUX1是極地生長素運輸系統的主要組成部分，因此，穩定的PTI幹擾了主動的細胞間生長素運輸。
NIT2可能在R基因介導的抗生物營養性病原體的抗性和防禦中參與IAA信號傳導。研究測量的NIT4豐度增加了20倍以上，但具體功能未知。
13. PTI
JA，IAA和SA在建立SAR時按時間順序起作用，而JA起作用較早。因此，研究者測量了激素水平1、3和16小時 OPR3（作為JA合成的標記），JOX2和COI1和TPR1（作為JA信號的標記）的轉錄水平（圖6）。SA在1小時後積累，水平一直升高到16小時，JA和JA- Ile水平始終基本水平。在PAMP處理後1小時，OPDA水平增加，並保持升高，在PAMP暴露3小時後，OPR3轉錄物豐度增加了5.7倍，在16小時降低至基礎水平。綜上所述，這表明JA生物合成途徑在PTI早期被誘導。
flg22處理後，JOX2轉錄組從3小時大幅提高了，一直保持高至16小時，在防禦的早期階段，通過羥基化重啟JA合成。隨著時間的推移，COI1和TPR1轉錄本的豐度沒有明顯變化，表明在缺少JA-Ile情況下幾乎沒有JA信號。
圖6 flg22處理後1、3、16小時，植物激素定量
研究者在myc234在flg22處理後的植物激素的豐度。JASMONATE INSENSITIVE 1（MYC2）具有多種多樣的調節功能，而三重敲除基本上沒有功能上的冗餘，而 SA高度積累。其豐度在1小時和3小時後顯著下降，在16小時後增加了，這表明JA信號在PTI中的早期SA積累中起作用。
在整個過程中JA和JA-Ile的含量都大大增加。OPDA在突變體中也有所增加，其分布與野生型JA的相似，達到了flg22處理後三個小時4倍，表明JA生物合成途徑的誘導和JA中間體的合成獨立於MYC2。PAMP處理後3小時，IAR3和JOX2啟動子區域的MYC2結合位點有幾個豐度很高，說明MYC2的控制JOX2表達，JA雖然合成但被JOX2連續消耗（圖7）。
隨著時間的推移，其他植物激素在野生型和突變型中均顯示出相似的水平。游離IAA的數量沒有顯著變化，因為達到了穩態PTI。幼苗暴露於PAMP後1小時，ACC / ET的豐度已經增加，並保持較高水平。flg22處理後3小時，ABA下降，並且在整個時間過程中一直保持較低水平，這可能是由於與SA的已知拮抗作用。另外研究者測量了20種蛋白原胺基酸和其他一些胺基酸改變的水平，發現在flg22暴露過程中丙氨酸，甘氨酸，色氨酸和牛磺酸會增加。隨著接觸時間的延長，亮氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，脯氨酸和鳥氨酸的含量降低。
圖7 依賴MYC2的負反饋迴路通過IAR3和JOX2的去綴合和羥基化作用，控制JA-Ile和JA水平與JA合成平衡，從而抵抗生物營養性病原體。
此研究全面描述了擬南芥模型的蛋白質組學，闡明了植物和組織在整個生命周期中的蛋白質組格局，以及在前所未有的情況下對PAMP的免疫反應放入細節。重要的是，研究者強調了在這些不同的生物學情況之間蛋白質組結構的重塑，以推斷出全基因組蛋白的共同調節和功能。既包含了組織，生長發育階段特異蛋白質組學研究，同時還研究了植物激素，抗性相關的蛋白質組學，全面而深度的蛋白質組學數據為相關研究提供了豐富研究素材。