液質聯用分析葛根提取物及中藥片劑中異黃酮類化合物

    作者：田宏哲,王華,關亞風 

       摘要:採用反相C18毛細管液相色譜柱,以乙腈(含0.1%(體積分數,下同)三氟乙酸)和水(含0.1%三氟乙酸)為流動相梯度洗脫,在26min內分離了葛根異黃酮提取物以及愈風寧心片中的主要成分。採用毛細管液相色譜/四極杆飛行時間串聯質譜儀對葛根提取物以及片劑中的幾種主要異黃酮類化合物做了結構分析,發現葛根素是主成分(提取物中其平均質量分數是13.32%;片劑中每片含量19.28～24.34mg)。對微量未知化合物,用它們的子離子譜圖與已知化合物的譜圖比較,推測其成分為3-甲氧基葛根素和3-甲氧基大豆苷。
    關鍵詞:反相毛細管液相色譜；液相色譜；電噴霧離子質譜；葛根異黃酮；葛根素；中藥
    野葛(Pueraria lobata (willd.) Ohwi)為豆科(Leguminosae)葛屬植物, 是重要的藥用植物之一,其根為常用生藥(其中黃酮類化合物的質量分數可達10%～14%) ,具有降低血管阻力,改善心、腦血液循環, 減慢心率, 降低心肌耗氧量等藥理作用,在肌體抗氧化、退熱止汗、治嘔吐、防治老年痴呆症等方面也有治療作用。葛根中主要異黃酮成分為葛根素(puerarin) 、大豆苷(daidzin) 、大豆苷元(daidzein)等, 據報導幾類化合物都具有藥理活性。
    ,對葛根異黃酮提取物的測定方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法以及　野葛( Puera rialobata (willd.)Ohwi)為豆科(Leguminosae)葛屬植物, 是重要的藥用植物之一,其根為常用生藥(其中黃酮類化合物的質量分數可達10%～14%) ,具有降低血管阻力,改善心、腦血液循環, 減慢心率, 降低心肌耗氧量等藥理作用,在肌體抗氧化、退熱止汗、治嘔吐、防治老年痴呆症等方面也有治療作用。葛根中主要異黃酮成分為葛根素(puerarin) 、大豆苷(daidzin) 、大豆苷元(daidzein)等, 據報導這幾類化合物都具有藥理活性。
    目前,對葛根異黃酮提取物的測定方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法以及毛細管電泳紫外、螢光或者電化學檢測法等。但上述方法無法對提取物中的未知化合物進行定性。液相色譜2質譜聯用技術(LC-MS)已廣泛應用於未知化合物的定性分析,尤其近年來發展起來的生物質譜採用軟電離和串聯質譜技術,可得到很強的分子離子峰以及易於解析的分子碎片峰,從而可確定基團的連接位置,進一步推斷化合物的結構。
    本文以優化的乙腈-水(含0.1%(體積分數)三氟乙酸)流動相體系, 用梯度洗脫模式分離了葛根提取物以及葛根製劑愈風寧心片中的主成分(葛根素、大豆苷、大豆苷元等) ; 同時採用LC-MS-MS對提取物中的異黃酮類化合物進行定性。結果表明,該方法適用於上述活性成分的定性分析。
    1　實驗部分
    1. 1　儀器與試劑
    毛細管液相色譜系統:Micro-Tech毛細管液相色譜儀,四元梯度泵, Linear 200 UV-VIS檢測器,Chrom-Perfect色譜工作站(Micro-Tech Scientific Inc) 。LC-MS聯用系統:Waters 毛細管液相色譜(CapLC)系統,包括自動進樣器、三元高壓微流量泵系統、二極體陣列檢測器(PDA) 、電噴霧-四極杆飛行時間串聯質譜儀( ESI-Q-TOF) (Wa ters公司)和Masslynx質譜工作站。
    試劑:乙腈,甲醇(色譜純, Fluka公司),實驗用水為娃哈哈純淨水。乙醇、三氟乙酸、醋酸銨均為分析純。葛根素、大豆苷元購自中國藥品生物製品檢定所(含量≥98% ) 。
    1. 2　樣品的配製
    葛根提取物(總異黃酮含量(質量分數)≥40% )由西安天誠醫藥生物工程公司提供。精確稱取葛根提取物10mg,置於10mL容量瓶中,採用甲醇定容至刻度並搖勻。所有溶液用0.45μm微孔濾膜過濾,濾液保存於4℃冰箱中備用。
    葛根製劑愈風寧心片(北京同仁堂科技發展股份有限公司製藥廠)供試品溶液的製備: 取本品一片( 0.28g/片) , 除去糖衣, 研碎, 精密稱取0.223mg,放入5mL 帶刻度離心管中, 加入5mL30%(體積分數,下同)乙醇,超聲處理30 min後,冷卻,用30%乙醇補足減少的體積。搖勻後,靜置1h,然後離心( 3000r /min) 30min,取上清液過濾, 濾液
作為供試品溶液,保存於4℃冰箱中備用。
    1. 3　分析條件
    1. 3. 1　液相色譜條件
    C18毛細管液相色譜柱(150mm×0.32mmi.d.,5μm ,Micro-Tech Scientific Inc) 。流動相A為含0.1%(體積分數,下同)三氟乙酸的乙腈溶液,流動相B為含0.1%三氟乙酸的水溶液,梯度洗脫:0～30min, 流動相A的體積分數由5%到40%;在隨後的5min, 流動相A的體積分數為95%。在下次分析前用體積分數為100%的流動相B平衡10min,流速8.0μL /min。檢測波長248nm ,柱溫25℃,進樣量320nL。
    1. 3. 2　液質聯用分析條件
    C18色譜柱(100mm×0.32mm i.d.,5μm,Waters) ,流動相A為10mmol/L醋酸銨乙腈溶液,流動相B為10mmol/L醋酸銨水溶液,梯度洗脫:0～30min,流動相A的體積分數由5%到70%,流速4.0μL/min。PDA檢測波長210～400nm,柱溫25℃,進樣量200nL。
    質譜分別採用正、負離子檢測模式:正離子模式下毛細管電壓3030V,錐孔電壓30V。負離子模式下毛細管電壓- 2250V,錐孔電壓35V,掃描範圍m/z200～800。乾燥氣為N2,流量450L/h,脫溶劑氣溫度200℃,離子源溫度80℃。用氬氣作碰撞氣進行碰撞誘導裂解(CID) ,碰撞能量15～35eV。
    2　結果與討論
    2. 1　微柱液相色譜分離
    葛屬植物成分複雜, 其中主要活性成分為異黃酮類化合物。目前在葛屬植物中已經發現了大約35種異黃酮類化合物,而在葛根提取物中主要存在葛根素、大豆苷、大豆苷元和染料木苷等異黃酮。在甲醇-水體系下,葛根提取物中的主成分葛根素與其他成分難以完全分離。本文採用乙腈-水體系,分離了葛根提取物中的幾種異黃酮。葛根提取物中的主成分葛根素(平均質量分數為13.32%)的保留時間、峰高和峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.18%,1.53%,3.18%(n=5) 。
    2. 2　葛根片劑的分析
    採用上述優化條件, 對愈風寧心片樣品溶液進行測定。在葛根提取物樣品中,葛根素的平均(n=5)保留時間為2.14min;而在片劑樣品中,葛根素的平均(n=5)保留時間為2.20min。片劑中葛根素(含量為19.28～24.34mg /片)的保留時間、峰高和峰面積的RSD(n=5)分別為1.26%,4.79%,7.17% ,說明方法的重現性較好。因此採用該流動相組成和梯度洗脫方法, 可以對中藥提取物以及中藥製劑中的葛根素進行定
性分析。
    2. 3　葛根提取物的LC-MS分析
    其中1, 2, 3, 4號峰的紫外吸收光譜圖可看出,1,2,3,4號峰的紫外吸收光譜與異黃酮類化合物的紫外特徵吸收峰相似。
    用葛根素和大豆苷元標樣分別在正離子模式和負離子模式下直接進樣,所得質譜圖(未列出)表明,在正離子模式直接進樣的情況下,由於加和離子的存在以及溶劑中雜質在該模式下易於離子化而形成幹擾,譜圖比較複雜, 因此無法進行深入的解析。而在負離子模式下直接進樣的譜圖比較清晰, 沒有雜質峰幹擾。因此,本文採用毛細管液相色譜與質譜聯用,在負離子模式下進行分析,得到總離子流圖。
    從總離子流圖中幾個主要峰對應的質譜圖可以發現,圖中9.77min流出峰的質譜特徵峰的m/z與大豆苷元的質譜特徵峰的m/z253([M-H]-)相同,因此可以斷定該峰為大豆苷元。圖中5.70min流出峰的質譜特徵峰的m/z值與葛根素和大豆苷的相同,但無法確定是這兩種異構體中的哪化合物,因此採用LC-MS/MS對該峰進一步進行碎片分析。從文獻可知,葛根素在8位形成糖苷,屬於碳苷類異黃酮;而大豆苷在7位形成單糖鏈苷,屬於氧苷類異黃酮。氧苷類異黃酮的單糖鏈與異黃酮通過C—O鍵相連, 其穩定性弱於通過C—C鍵相連的碳苷,因此在形成子離子時,主要失去了相對分子質量(Mr)為162的碎片離子,形成糖苷配基大豆苷元的脫質子峰,其m/z為253。因此可以推斷,5.70min流出峰為大豆苷。從圖可以看到,2.93min流出峰是多組分。我們分別以m/z415,445,546為母離子進行MS/MS分析。在碰撞能量僅為15eV時,該化合物即失去了Mr為120的碎片離子而形成m/z 297的子離子,因此可以推斷其為碳苷類異黃酮葛根素。
    母離子445失去一個Mr為120的碎片離子形成325.04的子離子峰,隨後的碎裂片斷既包含了氧苷也包含了碳苷的碎裂途徑,因此推斷該化合物可能是3′2甲氧基葛根素和3′2甲氧基大豆苷的混合物。2.93min流出的峰以m / z 546為母離子進行分析得到的子離子譜圖,該母離子的碎片峰沒有給出太多的結構信息,雖然與72木糖葛根素的特徵峰m/z547([M-H]-)相似,但目前還無法確定該化合物結構。
    可確定3.15min流出峰主要為葛根素,4.34min流出峰為大豆苷。由於大豆苷元含量低,因此在聯用分析中未被檢測到,但在質譜直接進樣分析中發現存在微量的大豆苷元以及m/z為445, 546的化合物。對分子離子峰為m/z 445的化合物進行串聯質譜分析, 與葛根提取物中m/z為445的化合物碎裂片斷相同,可以確定為3′2甲氧基葛根素和3′2甲氧基大豆苷的混合物,而分子離子峰為m/z546的化合物目前還無法確定結構。
    3　結語
    本文以乙腈-水為流動相,在反相色譜中分離了葛根提取物以及中藥片劑中的主要成分。採用液質聯用方法對提取物及其片劑中的主成分進行了定性,並對其中兩種微量成分的結構進行了推測。但另外一種微量成分目前還無法確認, 對其結構需要進一步深入地研究。
參考文獻:
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