具中科博生研究表明,黏附細胞與懸浮細胞相比更難以大規模培養,因為需要提供大量的黏附額外表面,在儘可能利用空間的同時還要保持整個系統的勻質性。懸浮培養容量為1L的撞拌式容器與容量為1000L的容器相比各種參數極為類似,因此,懸浮培養常常是優先選擇的方案。中科博生。
細胞擴大培養的第一步多是從靜止的培養瓶(表面積可達200cm2)到轉瓶(表面積可達1750cm2)。大搖瓶的細胞產量可達(2X108)(5X108)個細胞,在大多數情況下,利用多個轉瓶培養細胞就可滿足需要。擴大培養的下—步是使用表面積較大的轉瓶,可由其內包含許多玻璃管或塑料螺旋膜層的轉機達到這一目的.通過這種方法轉瓶的表面積可增加到8500cm2和15 000cm2。中科博生。
一種旋轉式的細胞培養設備是利用多層塑料盤來類增加細胞培養面積,每層託盤的表面積為600cm2,每個培養瓶中最多可放宣40個託盤(總表面積可達32 000cm2)。目前有兩種系統均適合大規模的貼壁細胞培養,這兩種系統細胞黏附的底物分別是固定的柱床(由球形玻璃構成)和微載體(細胞黏附在200Mm的圓球狀基質上,用懸浮式細胞培養設備攪拌培養)。微載體可提供500050 OOOcm2/L細胞附著面積,目前商品化的培養系統容積可達1000L,總表面積達1.5X106 cm2,最多可支持1.5X1011個細胞附著生長。中科博生。
常用可多次使用的玻璃和塑料為材料的滾動培養瓶。最常使用的是大小分別為750850cm2和1500~ 1700cm2表面積兩種。完全的標準組件系統最多可容納48個大培養瓶。
下面以1500cm2面積為例說明滾動搖瓶的培養過程:
① 加入200300ml培養基;
② 接種1.5X107細胞量,
③ 以15r/min的轉速旋轉滾瓶;
④ 用倒置顯微鏡長期觀察細胞的生長狀況;
⑤ 細胞生長35d後,細胞匯合成片,細胞量大約為1.5X105個/cm2(人二倍體細胞)或5X105個/cm2(異倍體細胞如HeLa細胞);
⑥ 吸出培養基,用預熱的磷酸鹽緩衝液清洗貼壁細胞,加入20ml胰酶(0.25%)。將培養瓶放回到滾動設備中,旋轉2030min,細胞將會從瓶壁脫落,收集細胞,加入新鮮的培養基和血清,根據情況進行傳代培養。中科博生。
以上列出的操作過程可根據各種具體情況的不同而有所變動。這種方法的優點是培養基的體積和表面積的比例可以很容易地改變。如細胞經過生長期後,細胞表達的產品將要收集的時候,此時將細胞的培養基的體積減為100ml可大大提高表達產品的濃度。
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