至SARS-CoV-2大流行至今，尚無任何預防及治療方法獲批，而針對SARS-CoV-2的有效和普適性的疫苗上市時間仍懸而未定。因此，開發新的治療和預防方法仍然至關重要。
9月，我們曾對發表於《Naturenature Communications》雜誌的一篇文章做了報導，該文章描述，來自瑞典的科學家在一隻名為「泰森（Tyson）」的羊駝（alpaca）體內成功提取出可中和新冠病毒的納米抗體（單域抗體）Ty1。研究者發現Ty1會附著在與ACE2受體結合的刺突蛋白上，從而有效中和病毒。表明Ty1納米抗體可阻止病毒進入細胞，因此可以預防感染。
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-020-18174-5
事實上，這已經不是首次關於羊駝納米抗體可中和新冠病毒的報導，今年5月，《Cell》雜誌同樣介紹了比利時根特大學及德克薩斯大學奧斯汀分校等機構科學家發現的來自大羊駝（也叫美洲駝，Llama）的新冠中和抗體。
DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.031
近日，在一項發表於《Science》的新研究中，來自美國加州大學舊金山分校等研究機構的研究人員通過篩選酵母表面展示文庫（含有大於2×109種合成納米抗體序列）中與S蛋白胞外結構結構域（ectodomain）結合的納米抗體序列，分離出中和SARS-CoV-2的納米抗體。
DOI: 10.1126/science.abe3255
在這項研究中，研究團隊往大羊駝體內注射了新冠病毒S蛋白的一種突變形式SpikeS2P作為抗原。SpikeS2P缺乏S1和S2結構域之間的兩個蛋白裂解位點之一，並引入兩個突變和一個三聚化結構域（trimerization domain）來穩定S蛋白的融合前構象。他們用生物素或用螢光染料標記SpikeS2P，並通過磁珠結合和螢光活化細胞分選，來選擇展示納米抗體的酵母（圖1A）。
圖1.發現兩種不同類別的抗S蛋白納米抗體。圖片來源：Science,doi:10.1126/science.abe3255
三輪篩選產生了21個獨特的結合SpikeS2P的納米抗體，而且ACE2胞外結構域（ACE2-Fc）的二聚體構造體可降低這種結合。這些納米抗體分為兩類。第I類納米抗體結合RBD並直接與ACE2-Fc競爭（圖1B）。這一類的典型例子是納米抗體Nb6，它可與SpikeS2P和RBD單獨結合時，結合常數KD分別為210nM和41nM（圖1C）。第II類納米抗體，以納米抗體Nb3為例，它結合SpikeS2P(KD=61nM)，但不顯示與RBD單獨結合。在存在過量ACE2-Fc的情況下，Nb6和其他I類納米抗體的結合完全被阻斷，而Nb3和其他II類納米抗體的結合則適度下降（圖1B）。
這些結果表明，I類納米抗體以RBD為靶點阻斷ACE2結合，而II類納米抗體以其他表位為靶點。事實上，表面等離子共振（SPR）實驗表明I類和II類納米抗體可以同時結合SpikeS2P（圖1D）。與SpikeS2P相比，I類納米體與分離的RBD的結合呈現出一致更快的結合速率常數(ka)，這表明RBD可及性（accessibility）影響了KD。接下來，這些作者測試了I類和II類納米抗體抑制螢光標記的SpikeS2P與表達ACE2的HEK293細胞結合的效率（圖1E）。
I類納米抗體Nb6和Nb11作為兩個最有效的克隆出現，IC50值分別為370和540nM。II類納米抗體在該試驗中幾乎沒有表現出活性。他們優先選擇了兩種I類納米抗體：Nb6和Nb11，它們強勁地結合SpikeS2P，與SpikeS2P或RBD結合之間的ka差異相對較小。對於II類納米抗體，他們優先考慮Nb3，這是基於它在純化過程中較高的相對產量。
阻止SARS-CoV-2進入宿主細胞的策略旨在阻斷ACE2-RBD的相互作用。雖然高親和力的單克隆抗體作為潛在的治療方法處於領先地位，但是它們通過哺乳動物細胞表達產生的成本很高，並且需要由醫療保健專業人員進行靜脈注射。預防性使用需要大劑量，這是因為只有一小部分抗體能穿過氣道內的上皮細胞層。相比之下，納米抗體可以廉價地在細菌或酵母中產生，且納米抗體固有的穩定性使得它們能夠直接霧化遞送到鼻腔和肺部上皮（圖2）。
圖2mNb6和mNb6-tri在霧化，凍幹和熱處理後仍保持活性。圖片來源：Science,doi:10.1126/science.abe3255
事實上，靶向呼吸道合胞病毒的三聚體納米抗體（ALX-0171）的氣溶膠遞送最近被證明可以有效地降低住院嬰兒的可測量病毒載量。另外，駱駝類衍生納米抗體的潛在免疫原性可以通過既定的人源化策略來降低。
納米抗體多聚體化已被證明可以提高靶標親和力（affinity）。針對Nb6和mNb6而言，同時參與所有三個RBD的多聚體結構的結構引導設計，可顯著提高他們的效力。此外，鑑於RBDs必須處於向上構象才能與ACE2結合，因此對RBD可訪問性的構象控制可作為一種附加的中和機制發揮作用。事實上，當mNb6三聚體（mNb6-tri）與S蛋白結合時，它通過直接封閉結合位點和將RBD鎖定在非活性構象來阻止ACE2結合。
總的來說，研究者發現的II類中和納米抗體展示了一種破壞S蛋白功能的潛在新機制。在預防或治療性雞尾酒療法中配對使用I類和II類納米抗體或可中和和阻止SARS-CoV-2的逃逸變體。因此，這些作者發篩選出的抗S蛋白納米抗體的組合穩定性、有效性和多樣化的表位參結合為限制COVID-19大流行造成的持續死亡提供了一種獨特的潛在預防和治療策略。
參考資料：
1.An ultrapotent synthetic nanobody neutralizes SARS-CoV-2 by stabilizing inactive Spike