上一期主要介紹了有關流式分析功能的相關內容，
而作為剛剛得到數據的科研萌新，
你是否還苦於從複雜的數據中抽絲剝繭？
為如何做出精美的流式圖而苦惱？
不要著急，
流式數據分析才剛剛開始...
Flowjo於20世紀90年代由史丹福大學Mario Roederer等人開發，從起初的V1版本到目前的V10版本，經歷了和Windows一樣長的發展歷史，在頂尖免疫學雜誌使用率≥97%。
Flowjo具有全面專業分析功能，簡單易用卻又功能強大，幾乎兼容所有流式儀器採集的數據。除歷史悠久外還具有以下特點：
1、專項功能豐富
具有補償調整矩陣，對於各種原因所導致 的未進行事先的補償調節，可以後續在flowjo 一鍵調節；
FCS文件全兼容。
2、增強分析功能豐富
可進行Java Script自動細胞群分析。
具有Plugins定製功能：flowSOM，flowAI，t-SNE等（見文末高階應用）。
3、輸出高質量圖形結果
常見偽色圖（pseudocolor），等高線圖 （contour），密度圖（density），斑馬圖 （zebra），點圖（dot plot）及峰圖 （histogram），3d熱圖（heatmap with 3rd）
優化更新迅速。
1、操作界面
工具欄，數據分組，不同組樣本的進一步分析
2、數據添加
兩種方法：
add sample→選擇路徑；
直接拖入。
3、雙擊文件打開，進行後續圈門及邏輯分析等操作
樣本較多時可通過添加關鍵詞進行備註。
4、對目的細胞群體的圖形分析
① 圈門工具
② 選擇螢光標記指標，進行目的細胞查看
③ 3d熱圖切換按鈕
④ 將偽色圖轉換為其他圖例類型
⑤ 設定門的屬性
⑥ 對圖形進行微調
詳情參照《Flowjo實用操作手冊》（後臺回復「傳送門」獲取此寶典）
5、數據分析中對照的使用
流式細胞術的常用對照請見上期，本期重點介紹FMO對照在flowjo中幫助設門的應用。
——FMO對照（fluorescence minus one）：即螢光扣除對照。可幫助確定設門邊界，同型對照可幫助明確染色問題，未染色對照可幫助確定染色背景或自發螢光。
FMO對照是設門的理想參照，而且可用於補償調節。所謂FMO對照，是染色方案裡面，去掉所要分析的某一指標，比如要分析FITC通道的螢光表達率，就要從所有染色組合中去掉FITC標記的抗體。
如圖：
未染色標本或同型對照均無法正確設置設門邊界，而FMO對照可以（FMO幫助去除全染管拖尾的部分信號）。FMO對照可以在補償未調節到位時依然幫助正確設門。
——死/活細胞對照：live/dead染料可用於後續固定破膜的檢測方法。此類氨基反應性染料與細胞表面或者內部的游離胺不可逆的結合，因而使活細胞呈弱陽性，死細胞呈強陽性。
圈門順序：前向和側向→FVS圈出單細胞群體，去除黏連部分→使用live/dead染料圈出活細胞群體→根據邏輯關係圈定目的細胞群體。
6、對目的細胞群體的統計分析
選擇想要進行統計的細胞群體→選擇Tools→選擇add statistic增加數據分析功能→選擇統計指標
7、圖例數據的導出
layout editor的使用。
點擊layout editor按鈕→選擇create layouts→將各組分析的數據拖拽至layout界面（大家可以自行體驗此界面的各個按鈕功能，拖拽至layout界面的圖例還可以在點擊之後進行更多的編輯，根據自己的需要進行調節，詳見操作手冊→（後臺回復「傳送門」獲取）。
Create batch report：點擊後對所有的sample進行相同的設置。
8、統計數據的導出
table editor的使用。
點擊table editor按鈕→將各組分析的數據拖拽至layout界面（與圖例數據操作相似）。
同樣的table editor界面也有Create table按鈕，點擊後對所有的sample進行相同的設置。
9、數據保存
File Tab→Save as→Export as a Template（WSPT）以模板形式保存，再次打開可以運行前次的分析邏輯。
上篇已經介紹了補償存在的相關原理及分析儀器上補償調節的方式，本篇將繼續介紹使用flowjo對補償進行調節的方法。
1、將單染管拖至補償分組後，compensation圖標即被點亮，雙擊打開自動補償界面。
2、當陽性和陰性群體區分比較明顯時，flowjo可以自動進行補償調節（應顯示為綠色，當顯示為黃色時，表示雖然可以識別但需要手動移動gate的位置，若為紅色則為未識別陰性與陽性群體）調整完後，點擊apply to group，對全部樣本進行補償的應用。
3、調節補償後，bandge會自動變色，雙擊任一個網格，會顯示相應的補償矩陣，點擊edit可手動對矩陣間的兩兩螢光進行調節，點擊M圖標進行全部應用。
以上介紹的是flowjo最基本的應用，另外flowjo還有許多高階應用，V10版本flowjo的大數據分析功能在多色流式中的應用也是非常吸睛，比如：
1、flowSOM plugin：直接生成FlowSOM聚類分析結果。
*Verhagen F H , Hiddingh S , Rijken R , et al. High-Dimensional Profiling Reveals Heterogeneity of the Th17 Subset and Its Association With Systemic Immunomodulatory Treatment in Non-infectious Uveitis[J]. Frontiers in Immunology, 2018, 9.
2、直接生成t-SNE降維分析結果及Heatmap
*Sundling C , Rnnberg C , Yman V , et al. B cell profiling in malaria reveals expansion and remodelling of CD11c+ B cell subsets[J]. JCI Insight, 2019, 5.
以上數據均為正版flowjo具有的plugins定製功能所繪製，有條件的小夥伴可以自行在官網：https://www.flowjo.com/index.php/solutions/flowjo/plugins下載相應的插件（配合官網代碼在R中食用更佳哦~）
最後想說：請大家支持正版！
後臺回復「傳送門」，獲取此寶典《Flowjo實用操作手冊》。