Western Blot詳解-常見的問題指南(三)

2020-12-15 生物谷

6. 染色的選擇

OO. Western Blot哪種染色好？
解答：（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測後容易從蛋白質中除去 ，以便進行隨後的胺基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
（2）膠體金，靈敏度高，檢測範圍可到pg級，但染色比穩定。
（3）生物素化靈敏度位於1、2之間，可用於任何一種膜。

7. 參照的疑問

PP. 是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內參？
解答：對於發表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。

QQ. 用BANDSCAN分析結果行嗎？
解答：分析一般的結果沒問題。

RR. 核內抗原Western Blot內參選擇什麼合適？
解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上查查就可以選出你要的內參。

SS. 轉膜時採用電流是否比電壓準確，是否根據0.8mA/cm2，一般1小時左右？
解答：不是的， 半乾法推薦用恆流，一般根據目的蛋白的大小來確定電流和時間。

TT. 做半定量人卵巢癌細胞系的Western Blot，內參B-actin，GAPDH，那個好？
解答：選用beta-actin就可以。

8. 緩衝液配方的常見問題

UU. 轉膜後的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什麼？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？
解答：轉膜後的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris－HCl就是Tris鹽用HCl調ph值，配置而成。

VV. 準備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質位於細胞核中，請問此蛋白質的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質是磷酸化的蛋白質，操作時如何防止去磷酸化的發生？
解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。

WW. 想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什麼原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？
解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區別。

XX. 最近作了兩次Western Blot，不但沒陽性結果，顯色背景都沒有，電泳和轉膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其餘同三去汙裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本--20度放置一周內測。2、一抗放置2年，可能效價不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不會背景都沒有把？3、第一次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均勻。後兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為 0.1%，不會是封閉液的問題吧？
解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1. 封閉液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問題。

YY. 加甲醇的目的是什麼？
解答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。


ZZ. 「轉膜後的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉」，其中TBST最後那個T是Tween嗎，濃度多大？
解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.

 

AAA. 封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什麼規定呢，比如現在我就在室溫裡做，或者要在4度下?
解答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然後4度過夜。

BBB. 實驗室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鮮加入：65mM DTT
蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)
是用於抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用於抽提細胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
改良的RIPA裂解緩衝液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脫氧膽酸鈉， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 μg/ml)不知對於膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制劑？
解答：做２－Ｄ絕對不推薦使用ＮＰ－４０（因為即使進口的ＮＰ－４０也不純，，其中的雜質會影響質譜結果）。對於動物細胞，其蛋白酶活性較弱（相對於組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因為7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ構成的變性環境已經足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ對於抽提膜蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議採用分級抽提法。此外還可以採用梯度離心法和一些基於去垢劑的方法。ＥＤＴＡ用於滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以導致蛋白質的修飾，做ＷＢ無所謂，做ＭＡＩＬＤＩ時會給正確鑑定帶來麻煩。裂解緩衝液中少了兩性電解質(在2-D裂解緩衝液中，兩性電解質起的作用：提供連續的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦採用SDS，因SDS會與蛋白質結合導致其等電點發生改變，如果您實在要用，終濃度降到0.1%以下。

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