一、目的
通過胺基酸的分離,學習紙層析法的基本原理及操作方法。
二、原理
紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。
層析溶劑由有機溶劑和水組成。
物質被分離後在紙層析圖譜上的位置是用Rf 值(比移)來表示的:
R=原點到層析點中心的距離
原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf 值是常數。Rf 值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離胺基酸。
三、器材
1、層析缸① 2、毛細管3、噴霧器4、培養皿
5、層析濾紙(新華一號)
四、試劑 蛋白實驗技術論壇 http://bbs.bbioo.com/forum-139-1.html
1、擴展劑
是4 份水飽和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。將20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏鬥中,與15mL 水混合,充分振蕩,靜置後分層,放出下層水層。取漏鬥內的擴展劑約5mL 置於小燒杯中做平衡溶劑,其餘的倒入培養皿中備用.
2、胺基酸溶液0.5%的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組份濃度均為0.5%)。各5mL
3、顯色劑50~100mL
0.1%水合茚三銅正丁醇容液。
五、操作
1、將盛有平衡溶劑的小燒杯置於密閉的層析缸中。
2、取層析濾紙(長22cm、寬14cm)一張。在紙的一端距邊緣2~3cm處用鉛筆劃一條直線,在此直線上第間隔2cm 作一記號如右圖。
3、點樣用毛細管將各種胺基酸樣品分別點在這6 個位置上,幹後再點一次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。
4、擴展用線將濾紙縫成筒狀,紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴展劑的培養皿建迅速置於密閉的層析缸中,並將濾紙直立於培養皿中(點樣的一端在下,擴展劑的液面需你於點樣線1cm)。待溶劑上升15~20cm 時即取出濾紙,自然乾燥或用吹風機熱風吹乾。
5、顯色用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然後置 烘箱 中烘烤5 分鐘(100℃)或用熱風吹乾即可顯出各層析斑點。
6、計算各種 胺基酸 的Rf 值。
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