北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）、北京未來基因診斷高精尖創新中心文路副研究員與首都醫科大學世紀壇醫院肝膽外科彭吉潤教授合作，利用團隊之前開發的甲基化CpG短串聯擴增與測序技術（MCTA-Seq），探究正常人、肝疾患者與急性胰腺炎患者外周血游離DNA的組織來源。研究成果以「Comprehensive DNA methylation analysis of tissue-of-origin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification and sequencing（MCTA-Seq） 」 為題在線發表於6月25日的《臨床表觀遺傳學》（Clinical Epigenetics）。
近年來，外周血游離DNA因其在無創產前DNA檢測與腫瘤液體活檢的臨床應用而受到廣泛關注。正常人外周血中也有一定濃度的游離DNA，主要來源於白細胞，但有多大比例來自其他組織器官尚不完全清楚。在多種疾病狀態下，游離DNA濃度會顯著增高，是否來自於受損組織或者另有其它來源，也是一個尚未解決的問題。DNA甲基化是DNA的主要表觀遺傳修飾。由於不同組織器官具有截然不同的DNA甲基化修飾模式，它非常適合於鑑別游離DNA的組織來源。在之前的研究中，課題組研發了一種分析外周血游離DNA甲基化組的新技術MCTA-Seq，在本項研究中，合作團隊將該技術應用於探究外周血游離DNA在生理與病理狀態下的組織來源問題。
研究者首先採用MCTA-Seq技術比較了14名正常人的血漿游離DNA與白細胞基因組DNA，發現有77個甲基化位點在血漿游離DNA中被特異檢測到。通過比較八種人體主要組織器官（肝、肺、胃、腸、腎、胰腺、皮膚和肌肉）的MCTA-Seq結果，他們發現，這77個血漿vs白細胞的差異甲基化位點主要是肝臟特異性甲基化位點（圖1）。作為一種互補的方法，他們鑑定了146個組織特異性甲基化標記物，比較血漿與白細胞，發現僅肝臟特異性甲基化標記物在血漿中顯著增高。這些結果提示，正常人外周血游離DNA，除了白細胞作為主要來源外，肝臟是另一個重要來源。為了定量計算組織來源DNA所佔比例，研究者建立了一種粒子群最優化算法。結果表明，正常人血漿游離DNA中肝臟來源比例為1.3%左右（圖2）。
圖1.MCTA-Seq鑑定血漿游離DNA/細胞差異性甲基化位點
圖2.正常人外周血游離DNA的組織來源
隨後，研究者採用MCTA-Seq結合粒子群最優化算法對13例膽石症患者、17例肝硬化患者、30例肝癌患者和8例急性胰腺炎患者進行了分析。結果表明，膽囊結石患者的游離DNA濃度及組成與正常人接近，而肝內膽管結石患者的肝臟DNA釋放顯著增加，可高達30%。肝硬化患者、肝癌患者和急性胰腺炎患者的游離DNA濃度均顯著高於正常人，這與已有文獻報導一致。急性胰腺炎患者外周血中升高的游離DNA過去普遍被認為可能來自受損的胰腺組織。然而，研究者通過MCTA-Seq組織來源定量分析意外地發現，白細胞才是急性胰腺炎患者外周血中游離DNA升高的主要來源（圖3）。另外，肝硬化患者外周血中升高的游離DNA也主要來源於白細胞，肝硬化患者的游離DNA升高則是肝臟細胞與白細胞共同過度釋放的結果（圖4）。
圖3.急性胰腺炎患者外周血游離DNA的組織來源
圖4.肝臟疾病患者外周血游離DNA的組織來源
正常人外周血游離DNA部分來自肝臟，提示肝臟細胞存在生理性凋亡和自我更新；肝內膽管結石患者與肝癌患者外周血中有大量肝臟DNA釋放，提示肝臟細胞在這些病理狀態下發生顯著死亡；急性胰腺炎患者升高的游離DNA主要來自白細胞，可能與免疫系統的急性炎症激活有關；肝硬化患者升高的游離DNA主要來自白細胞，則可能是脾功能亢進破壞血細胞的結果。
最後，研究者發現了一類新穎的適用於游離DNA檢測的組織特異性甲基化CpG島。這類CpG島位於組織特異性高表達基因內部，具有很強的組織特異性超甲基化模式（圖5）。
圖5.位於基因內部的肝細胞特異性超甲基化CpG島。F12為凝血因子XII基因，在肝細胞中特異性高表達。綠線顯示甲基化程度，紅色箭頭為MCTA-Seq所檢測的CGCGCGG
本項研究開發了組織來源定量分析新算法，揭示了外周血游離DNA在生理與病理狀態的複雜組織來源，鑑定了新的組織特異性甲基化標記物，拓展了MCTA-Seq應用於疾病檢測的前景。
北京大學生物醫學前沿創新中心、北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學學院博士生劉曉萌、任傑，北京首都醫科大學世紀壇醫院肝膽外科博士生羅楠為該論文並列第一作者。彭吉潤為該論文的共同通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學基金面上項目、北京未來基因診斷高精尖創新中心的基金支持。