基因晶片技術在檢測腸道致病菌方面的應用
摘要：當前，基因晶片技術被廣泛的應用於各種研究領域，如基因突變及多態性分析、細菌基因鑑定、致病分子機理、表達譜分析、DNA測序等多個方面。文中通過毒力因子的檢測、通用引物結合基因晶片來檢測腸道致病菌。隨著基因晶片技術的發展，也會伴隨著各種問題的產生，只有不斷地發現問題，解決問題，改進基因晶片檢測技術，才能不斷的完善基因晶片檢測技術。隨著檢測的目的的致病菌的種類的不斷的增加、基因晶片技術檢測方法不斷創新，使得基因晶片檢測技術不斷的成熟和完善。
關鍵詞：基因晶片 腸道致病菌 檢測
Gene chip technology in the detection of intestinal pathogenic bacteria
ABSTRACT ：At present, the gene chip technology is widely applied in various research fields, such as gene mutation and polymorphism analysis, identification, pathogenic molecular mechanism of bacterial genes, expression profile analysis, DNA sequencing, and other aspects.By detecting the virulence factors, general primer combination of gene chip to detect the intestinal pathogenic bacteria.With the development of gene chip technology, will be accompanied by the production of all kinds of problems, only by constantly to find problems, solve the problem, improve gene chip detection technology, to constantly improve the gene chip detection technology.With type of detection of pathogenic bacteria of the purpose of continuously increase, gene chip technology to detect method, continuous innovation, making gene chip detection technology continues to mature and perfect.
Keywords: Gene chip； Intestinal pathogens； Detection
當前在食物生產全球化的大背景下，由於人們飲食習慣的改變以及世界的環境衛生狀況越來越差，食品的安全性降低，引發了全世界人們的關注。由於食品安全性的降低，誘發了腸道致病菌的感染。因此，隨著人們關注食品安全程度的越來越高，自然的關注到了腸道致病菌的感染。當前，世界上有很多的國家都非常注重這個問題，並採取了相應的措施。當前，切斷導致病菌的傳染途徑，改善人們的生活條件和飲食條件已經成了刻不容緩的問題。本文所論述的正是基因晶片檢測技術在腸道致病菌檢測方面的應用。
一、基因晶片技術簡介
20世紀80年代，基因晶片技術誕生。它利用了生物化學、分子生物學等多個學科的現代技術，實現了樣品監測分析過程中的連續化、集成化和微型化。Ye等學者詳細的介紹了基因晶片技術在微生物方面的應用。基因晶片是指反向斑點雜交，特異探針以一定得方式固定在某種介質上，掃描時以點出現，每一個點代表一種特異性探針序列。這種技術可以檢測多種片段，比如：基因組DNA、總RNA 、a RNA、質粒RNA等等。標記的方法一般是利用螢光基因通過特定波長進行掃描檢測。
二、基因晶片技術檢測腸道致病菌
基因晶片技術不但提高了檢測的水平，而且能夠同時對多種致病菌進行鑑定，這是傳統的檢測方法如分子生物學、免疫學技術所不能比擬的。不僅縮短了檢測的周期，而且結果自動化分析，避免了由於操作人員的錯誤而導致錯誤的結果，是食品安全檢測方面的重大技術突破。
2.1 檢測腸道致病菌的毒力因子
當前科研人員選取各種致病菌特異性的毒力因子作為檢測的靶標。通過多重PCR的方法擴增多種致病菌，同時標記PCR產物，然後經過基因晶片雜交進行鑑定。Chizhikow 等學者以多重PCR擴增與食源性致病菌相關的6種毒力因子為基礎建立了一種基因晶片檢測系統，和晶片雜交的方式鑑定了6種基因。目前這種技術路線應用於少數腸道致病菌鑑定方面，效果良好。本實驗已經建立了一種用於甄別霍亂弧菌O139的基因晶片和出血性大腸桿菌O157：H7，通過檢測毒力基因以及SNP s位點，將霍亂弧菌O139和O1以及出血性大腸桿菌O157：H7和非H7。從實驗結果不難看出，通過多重PCR擴增，將致病菌的毒力因子作為檢測目標的靶細菌，以雜交篩選的方式和基因晶片相結合是完全可行的。充分體現了基因晶片檢測技術的的靈敏度高、特異性、等特點。彌補了多重PCR不能鑑定多種目的的片段的弊端。但是這種技術仍然受制於多重PCR，檢測的數量少。但是對於細菌分型等方面，非常適用。
2.2 通過引物結合基因晶片檢測腸道致病菌
2.2.1 通用引物擴增16S rDNA基因、23SrDNA基因
該2種基因具有非常重要的生物學意義，在生物進化過程中比其他的基因演變的慢，被稱為「細菌進化的活化石」。然而保守性是相對的，序列中仍然存在著特異性的片段，且不同菌屬差異性很大。因此，在細菌的保守性區域，設計通用引物，一次就可擴增出多種細菌的目的片段。然後採用標記法、滲入法以及末端標記法等，設計相對應的特異性探針，通過基因晶片與PCR產物雜交的結果對細菌進行鑑定。有的實驗室的基因晶片研究小組對致病菌的16S rDNA和23S rNDA基因進行檢測，建立了一種基於二重PCR方法的基因晶片檢測方法，可同時檢測15種腸道致病菌，檢測的靈敏度達到103 CFU/mL。
於選取的目的基因保守性相對較強，有些致病菌只能鑑定到細菌屬的水平，無法鑑定到細菌種的水平。但是與毒力基因檢測方法相比較，達到高通量檢測的水平，突破了檢測數量的限制，操作簡單，成本較低，適用於食品安全體系的監控等多個方面。
2.2.2 基因晶片直接檢測致病菌的16S rRNA基因
因為在一些較為複雜的介質中如土壤、糞便等，一些PCR反映抑制物存在，使得細菌核酸進行PCR跨增是非常困難的。解決方法之一是直接檢測致病菌的rRNA。
原理：將16S rRNA序列上不同種屬的特異性片段作為探針（1000 bp 左右），反轉錄標記後，直接檢測rRNA 可顯示介質中致病菌的死活狀態。方法弊端，靈敏度較低。
Guschin等學者開建立一種基於聚丙烯醯胺凝膠墊的基因晶片檢測系統，也適用於檢測16S rRNA。儘管直接檢測16S rRNA基因，能夠檢測致病菌的死活狀態，特異性很好，但是這種檢測的實驗條件和操作者的水平要求較高，靈敏度較低。並且該方法還受到致病菌所處的生長狀態和介質形態等因素的影響。因此很難再實際的檢測中推廣。
2.2.3 基因晶片直接檢測致病菌的DNA
直接檢測DNA同樣可以解決複雜樣品中存在酶抑制物的問題。其原理與直接檢測rRNA相似。由於DNA本身更加的穩定，易操作而且在細菌體內的含量較高，所以直接檢測DNA的方法不能確定致病菌的死活狀態，但卻能夠更好的鑑定腸道致病菌。
Sekowshi 等學者通過基因晶片與基因組DNA雜交的方法，從而區分腸出血性大腸桿菌O157:H7和非致病性大腸桿菌，該方法的靈敏度要高於免疫學的方法。
當樣品中含有較低濃度的致病菌時，直接檢測樣品中分離出的DNA相當的困難。並且不同的菌屬之間存在許多的同源序列，不可避免的就存在很多同源性序列交叉現象，而且對探針的設計要求很高。對結果影響較大。因此與結合PCR擴增的基因晶片方法相比，這種方法限於實驗室的基礎研究。
三、基因晶片用於細菌分型
基因晶片檢測致病菌技術還可以應用到微生物的基礎研究過程中，通過對致病菌基因組DNA、rRNA進行遺傳分析，從而計算出細菌種屬間的遺傳距離以及判斷分析菌體的毒性等。Borucki等學者建立了一種鑑定不同血清型的單增李氏菌的基因組晶片，從而清晰的將24種單增李氏菌區分為倆種類型。該基因組分型晶片的結果正確與否要同足跡法技術比較，該實驗結果與足跡法技術一致，結果正確。本實驗室建立了炭疽桿菌基因組晶片，通過與其他芽孢桿菌組雜交，鑑定出炭疽桿菌特異性基因。這種方法適用於高通量的篩選出多種差異基因，還可以對更大規模的基因進行篩選，可以應用到細菌致病分子機理等基礎研究中。
四、基因晶片在腸道致病菌檢測方面存在的問題及解決途徑
4.1 基因晶片在腸道致病菌檢測方面存在的問題
基因晶片技術雖然彌補了傳統檢測方法的很多不足之處，比如不能同時檢測大規模樣品、檢測方法繁瑣緩慢，結果不夠準確。但是由於基因晶片技術發展時間較短，所以本身仍然存在很多的不足之處。
1. 當前由於存在很多的基因製備方法，導致各個實驗室的基因晶片的性能無法比較，而且基因晶片缺乏穩定性。
2. 雖然螢光基因標記技術成熟，但是螢光染料非常昂貴，並不適合大規模和常規的使用。
3. 基因晶片技術不如PCR等技術靈敏度高，在少量致病菌感染的情況下可能會出現陰性結果。
4. 新發的各種腸道致病菌不斷的出現和變異。4.2 基因晶片在腸道致病菌檢測方面存在的問題的解決的方法
1. 本實驗室基因晶片小組在將可視化技術結合到基因晶片技術檢測中，取得了一定得成果。該技術能夠使得肉眼判斷晶片雜交結果，可降低實驗成本，簡化操作流程。
2. 基因晶片的靈敏度可通過改善核酸提取技術改善。研究高效的提取方法。
3. 針對腸道致病菌的不斷出現和變異可通過增加基因晶片檢測中靶細胞來改善。
綜上，可以知道雖然基因晶片檢測技術存在很多的問題，但是也取得一定得成果，
五、基因晶片在腸道致病菌檢測方面的前景
本文所論述的基因晶片技術應用於腸道致病菌中的檢測，不僅提高了檢測的能力，而且實現了同時對大規模樣品的檢測，成為一次具有革命意義的技術突破。當前在國際上，基因晶片技術已經得到廣大的科研工作者的認同，成為了當前分子診斷和遺傳分析重要的技術平臺。隨著檢測目的致病菌的種類不斷的增加、基因晶片技術檢測方法不斷創新，使得基因晶片檢測技術不斷的成熟和完善。將來應用於腸道致病菌的基因檢測技術將會得到大規模的應用，呈現出更廣闊的應用前景。
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