王國建 戴樸等（解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科）
中華耳科學雜誌2008年第6卷第1期
耳聾是一種嚴重影響生活質量和交流的常見疾病。它可以由單一基因突變或不同基因的複合突變引起，也可由環境因素，或基因與環境兩者共同作用而致[ 1] 。50%的兒童期耳聾被認為與遺傳因素有關[ 2] ，而70%的遺傳性耳聾表現為非症候群耳聾（即除耳聾外不伴有其他症狀和體徵）。迄今為止，與非症候群耳聾相關的25 個常染色體隱性基因、21個常染色體顯性基因、1個X 連鎖基因已被克隆（
http://webh01.ua.ac.be/hhh/）（更新日期2008年2月7日），而每個基因中又散在數目眾多的耳聾突變位點，因而具有較高的基因和位點遺傳異質性。最近，在國內開展的大規模耳聾分子流行病學研究表明，相當一部分非症候群性耳聾僅由為數不多的幾個基因突變引起[ 1] ，如GJB2 [ 3] 、SLC26A4 [4] ，mtDNA 12s rRNA [5] 及GJB3 [6] 等，這為我們大規模開展耳聾基因篩查及診斷提供了理論依據。
目前，傳統基因診斷方法包括酶切，限制性片段長度多態性分析（restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP），DHPLC，直接測序等，這些方法或者不能定性，或者耗時費力、所需設備和耗材昂貴，更重要的是這些方法難以同時對不同基因的多個突變位點進行檢測。因此有必要建立一種高通量、高效率的基因突變檢測方法，以實現臨床快速檢測或大規模人群篩查。而伴隨基因組計劃出現和發展的基因晶片技術，以其固有的高效平行檢測特點，與耳聾基因高遺傳異質性的特點相契合，是一種極具潛力的耳聾基因檢測工具。
我們與博奧生物有限公司合作，在大規模全國聾病分子流行病學調查數據基礎上，針對國人非症候群性耳聾的突變熱點，將等位基因特異性引物延伸PCR 與通用晶片相結合，合作開發了一款遺傳性耳聾基因診斷晶片，並用其檢測了158 例非症候群性耳聾患者，對其在臨床應用的可行性進行了初步研究。
1. 對象和方法
1.1 研究對象
北京第三聾人學校的158 名非症候群性耳聾學生，其中男92 例，女66 例，年齡7歲～24 歲，平均年齡為15.3 歲。根據純音測聽結果，158 人均為感音神經性耳聾。155 人為重度以上耳聾（70 dB 以上），3 人為中度耳聾（41 ～70 dB）。發病年齡從出生到7 歲；152 例為語前聾，6 例為語後聾。
1.2 DNA 提取
用含枸櫞酸鈉抗凝劑的真空採血管採集受檢者3ml ～5ml 外周靜脈血，應用小劑量全血基因組DNA 提取試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）提取DNA，用BECKMAN DU800 紫外分光光度計進行定量和純度檢測。
1.3 基因晶片檢測
1.3.1 檢測原理
針對不同突變位點設計兩種帶有不同標籤的上遊探針和一個下遊帶Cy3 螢光標記的公共引物，先在液相中進行多重等位基因特異性引物延伸PCR，PCR 擴增產物在帶上一段標籤序列（tag sequence）的同時，被單色螢光所標記。
將產物變性後，與固定有標籤互補寡核苷酸序列的晶片雜交，通過雷射掃描檢測出突變位點[7]。
1.3.2 儀器及試劑
ABI 9700 PCR 儀，恆溫水浴箱（國產長風），HZQ- C 空氣浴振蕩器。本實驗中所用的的螢光標記引物，以及晶芯LuxScan™10K/B 微陣列晶片掃描儀及相應軟體系統、質控探針和DNA 晶片、雜交盒及雜交試劑由博奧生物有限公司提供。
1.3.3 PCR 反應
將針對11 個突變位點的11 組引物分成7Mix 和4Mix 兩個反應體系分別進行多重PCR，在每個15 !l 反應體系中加入100 ng 模板DNA，10 × hotstar buffer，2.5 mmol/L dNTP，25 mmol/L MgCl2，引物Mix，5U/μl hotstar 酶以及ddH2O。PCR 程序：95℃15min，96℃1min 預變性，94℃30s、55℃30 s、72℃45s 共32 個循環，70℃45min，60℃10min。在擴增過程中，參數設置使溫度以0.5℃/s 的速度從94℃降溫至55℃；以0.2℃/s 的速度從55℃升溫至70℃。
1.3.4 雜交
將PCR 產物加熱至95℃變性5 min，立即浸入冰水混合物中冰浴3 min。從兩個不同的擴增體系管中各取2.5 μl PCR 產物加入到10 μl 雜交緩衝液管中。將混合液加到晶片的點樣區域，加蓋玻片，封閉雜交盒，然後放入50℃預熱雜交箱中保溫1 h。
1.3.5 洗片
取出晶片，在42℃洗滌液Ⅰ中以搖床洗滌2 min，迅速取出放入已經預熱好的另外一杯42℃洗滌液Ⅱ中，搖床洗滌2 min。將晶片或玻片架放入適當的容器，置入離心機中以1200 rpm離心2 min 甩幹。
1.3.6 掃描
晶芯LuxScanTM 10K/B 微陣列晶片掃描儀以90 的雷射掃描強度和532 nm 激發波長進行晶片掃描。
1.3.7 結果判定
若在同個位點中A 列檢測數據為陽性，同時B 列也為陽性，判讀結果為該位點突變雜合型；若在同個位點中A 列檢測的數據為陽性，同時B 列為陰性，判讀結果為該位點野生型；若在同個位點中A 列檢測的數據為陰性，同時B 列為陽性，判讀結果為該位點突變純合型；若在不同位點中出現上述情況的組合，則判讀結果為多位點複合突變（圖1）。
1.4 GJB2 編碼區序列及SLC26A4 基因序列檢測
採用戴樸報導的方法[8] 進行引物設計、PCR擴增及直接測序。其中對於SLC26A4 基因，採用以下篩查策略：先篩查突變熱點區域第7 + 8、第19 外顯子；如發現純合或複合雜合突變即停止篩查，如發現單雜合突變則先篩查第10、17、15、3外顯子，然後篩查剩餘外顯子，直至發現另一個突變或篩查完全部外顯子。
1.5 線粒體DNA 12SrDNA A1555G 點突變檢測
應用Prev- DAF 藥物性耳聾基因診斷試劑盒檢測。
2. 結果
2.1 檢出陽性率
應用基因晶片方法在158 例NSHL 患者中檢出的陽性率為42.41%，應用傳統的酶切/測序方法的檢出陽性率為44.30% （表1）。部分檢測結果見圖2。
2.2 兩種方法對GJB2 突變等位基因檢出情況
對於晶片點陣所包括的GJB2 基因突變位點（235delC、299_300delAT、35delG、176del16），通過基因晶片法分別檢出等位基因突變58 個、10個、1 個及0 個，而用測序方法分別檢出60 個、10 個、1 個、0 個。對於前三者的等位基因突變檢出率，基因晶片法與測序方法的符合率分別為96.7% （58/60）、100% （10/10）和100% （1/1）。
對於235delC 位點，由於在晶片結果中將235delC 純合突變肉眼誤判為單雜合突變，使兩種方法符合率為96.7% （圖3）。
2.3 兩種方法對SLC26A4 等位基因突變檢出情況
對於晶片點陣所包括的SLC26A4 基因突變位點（IVS7- 2A>G、2168A>G），通過基因晶片法分別檢出等位基因突變27 個和6 個，而用測序方法分別檢出27 個和6 個。對於兩者的等位基因突變檢出率，基因晶片法與測序方法的符合率均分別為100% （27/27；6/6）。
2.4 統計分析
除兩例純合235delC 被判讀為雜合外，應用基因晶片檢測的結果同酶切及測序方法的結果一致，後者的陽性突變檢出率為44.3% （70 例）。經配對卡方檢驗（McNemar 檢驗），兩種方法在陽性病人檢出率間無統計學差異（P=0.250）。
3. 討論
基因晶片技術是隨著基因組計劃發展起來的生物技術，其基本原理是核酸雜交，即採用原位合成或合成後點樣的方法將許多特定的DNA 探針有規律地固化於支持物表面，產生二維DNA 探針陣列，將樣品DNA 或RNA 通過PCR 擴增並進行螢光標記，然後與晶片探針進行雜交，再用雷射或CCD攝影頭掃描儀掃描雜交信號，通過目測或軟體分析得到基因表達或突變的信息。基因晶片技術的出現和快速發展為高通量的SNP（單核苷酸多態性）和基因突變檢測帶來新的曙光。
耳聾具有較高的遺傳異質性。眾多的耳聾相關基因及位點不斷被發現，但傳統的檢測方法無法解決同時檢測多突變位點的問題，而基因晶片能夠提供高效的平行檢測平臺。目前，國外已有報導將一些較高通量的基因晶片運用到耳聾基因突變和多態性的檢測中[ 10，11] ，但是因所需設備及晶片造價昂貴或設計複雜，限制了大規模的耳聾基因篩查及臨床診斷的開展。而且，由於耳聾基因的遺傳及種族異質性，國外的晶片不能照搬，因此迫切需要開發一款適合中國國情及遺傳學背景，且準確、簡便、經濟的耳聾基因檢測晶片。
一般認為，遺傳性耳聾佔兒童期耳聾的50%，其具有較高的遺傳異質性。GJB2 基因和SLC26A4基因是非症候群性常染色體隱性遺傳性耳聾中最常見的兩個致病基因[ 12]。近年來國內大規模聾病分子流行病學研究也顯示，這兩種基因突變在非症候群型耳聾病因中共佔30%以上[ 4，13] 。兩者具有一些共同特點：都會引起重度和極重度感音神經性聾，都有突變熱點，且其突變熱點存在著顯著的種族差異。對GJB2 基因來說，高加索人熱點突變為35delG，猶太人熱點突變為167delT，而中國人的熱點突變為233- 235delC [ 14] ，其次為299_300delAT及176del16bp 等。SLC26A4 基因與大前庭水管症候群及Pendred 症候群的關係密切，在歐洲患者中，T416P 和L236P 是其最常見的兩種突變類型[ 15] ；而在中國，突變頻率最高的類型為IVS7-2A>G 和H723R [ 4，16] 。對於線粒體12S rRNAA1555G 突變，其攜帶率為3.4% [ 5] ，因其致病機制明確，而且檢出一例患者，即可對約10 名攜帶該突變但未發病的母系成員進行很好的預警效果，因此也是一線篩查的候選基因。另外，在中國克隆的第一個耳聾基因GJB3 中的E183K 和R180X 突變位點被認為與高頻聽力下降有關[ 6] 。這些分子流行病學信息對基因晶片的構建具有重要的指導意義。
我們將四個常見的耳聾相關基因中的9個國人熱點突變—— GJB2 （35delG，176del16bp，235delC及299_300delAT），GJB3 （538C>T 及547G>A），SLC26A4 （IVS7 - 2A > G、2168A > G）和線粒體DNA12S rRNA （1555A>G），以及兩個高加索人和猶太人頻發的耳聾位點——GJB2 167delT 和SLC26A4 的707T>C 設計在晶片位點中，以期用較少的探針即可達到較高的檢測效能。通過傳統方法的驗證，我們對該晶片的特點分析和總結如下：
（1）檢出率高：晶片點陣對重度以上耳聾患者的檢出陽性率較高，通過基因晶片，我們可以發現42.41%的陽性攜帶者，其中能夠確診的病人達29.11% （46/158），篩出的陽性率與傳統方法相比沒有統計學差別。儘管在複合雜合的檢出率有所降低，但只查到單雜合突變的病人也提示其有較大可能性為遺傳性耳聾並建議進行進一步的耳聾基因篩查。在本研究中，未發現167delT 和707T>C 突變，這與文獻報導的兩者為歐美突變熱點的結論相吻合，間接驗證了耳聾的種族異質性。
（2）通量高：基因晶片方法可以在5 個小時內走完PCR 反應到掃描全過程，完成11 個位點的檢測。而要用傳統方法進行這些位點的檢測，即便同時進行的話，至少需5 個PCR 反應，10 個小時完成。每張晶片可同時檢測四個個體，每次可同時檢測多張晶片。這些都充分體現了晶片技術高通量的優勢，其檢測速度可以滿足臨床要求。
（3）準確性高：通過對晶片和傳統方法結果相比較，晶片的準確率幾乎達到100%，這歸因於液相酶促反應的高特異性。在本研究中，僅在區別235delC 的純合或雜合突變時出現誤判（圖3），分析其原因可能為帶螢光PCR 產物與晶片標籤（Tag）探針的非特異性雜交造成噪聲信號增強而被肉眼誤判為陽性，可更換此點陣的Tag 序列，降低鹼基錯配的機率。經探針優化後，上述兩例誤判的235delC 樣品的晶片檢測結果均與測序方法一致，同時經測序證實的其他22 例235delC 純合突變樣品驗證，基因晶片的結果均與測序結果一致（圖3）。另外，將大批量樣本晶片檢測結果的野生型和突變型點陣的平均螢光信號值進行統計分析，設定區分兩者的CUT- OFF 值，應用判讀軟體進行自動判讀，可減少肉眼判讀的誤差。
（4）判讀方便：對晶片結果的判讀直觀，快捷。如配合判讀軟體則將進一步增加其準確性。
（5）設備要求不高：在臨床檢測過程中，除晶片外，僅需PCR 儀、恆溫搖床、水浴箱、雷射掃描儀等，其試劑價格相對低廉，因此這種耳聾基因晶片檢測系統的成本不高。雖然目前僅能夠檢測國人9 個基因突變熱點，但後者在遺傳性耳聾病因中所佔比例高，因而通過此款晶片能在重度以上的非症候群性耳聾患者得到較高的陽性檢出率（42.41%）；另外，由於此晶片平臺可通過不斷增加晶片Tag 探針來增加晶片檢測的位點數目，從而覆蓋更多的遺傳性耳聾突變熱點，因此具有很高的靈活性。但在增加檢測位點時，如何保持多重PCR 的穩定性是以後開發晶片時要考慮的問題。
與高通量基因晶片相比較，這款專為國人遺傳性耳聾設計的小型晶片，可以達到快速、敏感、準確診斷的目的；且其操作簡單，易於標準化，適於推廣，因而顯示出廣闊的臨床應用前景。
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