蛋白質翻譯後修飾在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質的結構更為複雜，功能更為完善，調節更為精細，作用更為轉移。常見的蛋白質翻譯後修飾過程有泛素化、磷酸化、乙醯化、糖基化等，同時還有一些特殊的翻譯後修飾如甲基化、巴豆醯化、戊二醯化，丙二醯化，琥珀醯化等在生物過程中起到重要的作用。
而今天小編想和大家共享的是關於泛素化研究，一直以來，人們都忽視了蛋白質水解酶參與細胞功能的調控，泛素和與其相關的蛋白水解酶的發現，給整個科學界帶來了突破性的影響。泛素由76個胺基酸組成，高度保守，普遍存在於真核細胞內，故名泛素。泛素化是可逆的，依賴ATP並且通過泛素激活酶E1，泛素結合酶E2，泛素連接酶E3一系列催化反應所致。
具體過程為首先在ATP(紅色所示)供能的情況下酶E1(蛋白質編號1r4n)粘附在泛素分子尾部(淡黃色所示)的Cys殘基上(綠色所示,注意在這個結構中,Cys突變為Ala)激活泛素,接著,E1將激活的泛素分子轉移到E2酶上(蛋白質編號1fxt),隨後,E2酶和一些種類不同的E3酶共同識別靶蛋白,對其進行泛素化修飾。根據E3與靶蛋白的相對比例可以將靶蛋白單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。E3酶(蛋白質編號1ldk和1fqv)的外形就像一個夾子,靶蛋白連接在中間的空隙內(星號所示)。酶的左側結構域決定靶蛋白的特異性識別,右側結構域定位E2酶以轉移泛素分子。
泛素化可以生產出單泛素化或多泛素化蛋白質。後者在當7個賴氨酸殘基的泛素與另一個泛素的甘氨酸C端連接形成。這種泛素分子連結在生物過程中起到重要的作用。共價結合泛素的蛋白質能被蛋白酶識別並降解，這是細胞內短壽命蛋白質和一些異常蛋白降解的普遍途徑。泛素化及類泛素化蛋白在細胞分裂，自噬，DNA修復，免疫應答，細胞消亡等方面同樣起到關鍵作用。與消化道內進行的蛋白質水解不同，從泛素與蛋白的結合到將蛋白水解成小的肽段，整個水解過程需要能量參與。人們開始意識到泛素-蛋白酶系統是一個對於真核細胞非常重要的調節系統。
1、泛素化實驗方案
（1）利用可以純化泛素化底物的抗體（PTM-1101）富集並利用高通量質譜檢測，該方案具有高靈敏度及高特異性。
（2）His-taggedubiquitin:該方案具有高特異性，但在有些生物樣本中面臨挑戰，如動物組織及臨床樣本。因為泛素化發生在個體分子中不同位點不同水平上，往往會導致富集出的蛋白在酶解後產生大量非修飾肽段影響結果鑑定。
2、泛素化研究挑戰和解決方案
1）挑戰
運用質譜檢測泛素化會發生很多假陽性結果，所以在實驗中需要非常小心的驗證。雖然泛素化質量偏移114.043 Da在質譜中可以精確檢測出，但是還有其他的一些情況也會導致114Da的質量偏移結果乾擾鑑定結果。具體狀況如下。
（1） 天冬醯胺但單同位素殘基質量分數為114.043Da；
（2） 在蛋白酶解過程中普遍運用碘乙醯胺（IAM）對肽段進行碘乙醯化反應，而此時半胱氨酸及賴氨酸（有時）上會發生碘乙醯化修飾增加57.021Da分子量；
（3） 其他胺基酸影響，亮氨酸與異亮氨酸單同位素質量分數為113.084Da以及他們m+1同位素質量分數為114 Da。
2）解決方案
（1）改變烷基化試劑或者調整烷基化孵化溫度；
（2）設置更高的質量準確度閾值及手動或軟體驗證的單一同位素質量。
3、實例分享
Scientific Reports: SAHA在蛋白質組、泛素化組及乙醯化組中的神奇關聯
來自安徽省立醫院，安徽醫科大學及杭州景傑生物科技有限公司的研究人員在SAHA（SuberoylanilideHydroxamic Acid）治療非小細胞肺癌（A549Cell Line)機制研究中取得重大突破，發現經過SAHA刺激治療後的非小細胞肺癌A549細胞系在蛋白質組，泛素化修飾組及乙醯化修飾組之間有著密切的crosstalk。本研究內容發表在2015年3月31日的ScientificReports雜誌上。
組蛋白去乙醯化酶（HDACs）作為重要的癌症診斷標誌物被人們熟知，而SAHA作為組蛋白去乙醯化酶抑制劑對CTCL（cutaneousT-cell lymphomas）癌症診療試劑首個被FDA認證的。該藥對非小細胞肺癌,乳房癌以及子宮癌都有較好的療效。在之前的研究中已經證實SAHA對癌細胞的蛋白質組及乙醯化修飾組有著明顯的影響，而是否還有別的修飾類型對其產生影響，修飾之間有無新的crosstalk還待深入研究。
在本研究中研究人員基於SILAC（stableisotope labeling by amino acids）標記，PTM-Biolabs生產的抗體富集及高解析度液相質譜定量技術對SAHA處理前後的A549細胞進行蛋白質組，泛素化組及乙醯化組進行分析。其中蛋白質組共鑑定到4302個蛋白質，其中2968個蛋白被定量。在生物學分析中上調蛋白大多集中在線粒體及內質網中，而下調的蛋白則集中在細胞核，染色質，核糖體，剪接體混合物及轉錄抑制因子混合物中，這說明SAHA的治療抑制了細胞轉錄。進一步通過該策略研究泛素化組，科學家們鑑定到613個蛋白質，1067個泛素化位點，其中586個蛋白質1012個泛素化位點被定量。而大多數泛素化修飾的蛋白都集中在細胞膜上，這說明泛素化在細胞膜上扮演了重要的角色。乙醯化組鑑定到551個蛋白質，1124個乙醯化位點，其中542個蛋白質1099個乙醯化位點被定量。同時在組蛋白層面鑑定到91個乙醯化位點，這是現在全球最大的SAHA處理A549細胞的乙醯化組資料庫。而這些上調的乙醯化蛋白和轉錄有著很大的關聯。
通過對蛋白表達水平分析科學家們發現蛋白質組與泛素化組呈現負相關，這也與泛素化導致蛋白質降解功能是相關的。而在對泛素化組與乙醯化組關聯性分析上科學家們發現在SAHA治療後呈現正相關性。非組蛋白的乙醯化和泛素化的轉錄因子可以通過轉錄組影響蛋白質組水平，而組蛋白的乙醯化可能通過表觀遺傳學影響蛋白質組學水平。
該研究首次在SAHA治療非小細胞肺癌中發現了泛素化修飾，並深度分析了該修飾生物學作用，讓蛋白質翻譯後修飾與蛋白質表達水平的相關性研究為今後該領域的研究起到了指導的作用。更為重要的是蛋白質組，泛素化組及乙醯化組crosstalk的研究對於擴展我們對SAHA治療肺小細胞癌的治療有了更為深刻的了解，為後期對該領域的機制研究提供了方向。