今天的重點是幫您整理一下LC-MS/MS定量分析的思路，與網友踩坑之後的的一些經驗。速速收藏吧~
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● 查閱文獻
● 做好樣品前處理，萃取濃縮分離純化
● 有條件的可先在HPLC上摸好LC條件，能夠基本分離更好，緩衝體系符合MS要求
● 溶劑包括水的純度，最好色譜純以上
● 新的色譜柱可能要先衝洗很長時間才能幹淨,某些樣品非常容易吸附在進樣閥和管路中，用溶劑清洗
● 質譜儀須校準，預熱時間要足夠長，氣流的穩定也很重要，液N氣閥開度要注意，達到穩定程度
● 首先，確定離子化方式：
ESI or APCI，POS or NEG
● 用10-100ppm的純樣，Q1 SCAN 察看存在哪些離子，要能夠看到待測的母離子，應明顯比周圍的噪聲離子高，通過改變DP,觀察離子的增減,若為POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判斷分子離子,如看不到則可能是濃度太低或離子化方式不合適，或選擇的溶劑體系不合適
● 母離子選M+H,或M-H最好,但有時只有M+NH4,M+Na等,這樣CAD能量可能需要高些,選擇[M+H]+，還是+NH4，+Na等，要由化合物決定。加合離子若穩定，則可用，不穩定則可能需換流動相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，靈敏度高；如含Cl可選擇2個母離子峰
● SIM與MRM，單級Q只能SIM，MRM可看成2個SIM，選擇性更好
● 再根據上一步確定的母離子進行PRODUCT SCAN，確保所有碎片離子都來自待測化合物，而不是溶液中的雜質，找出較強的碎片離子信息。還可改變CE，從中選定MRM需要測定的一對或更多離子對,為最後LC-MS/MS聯用做準備
● 做PRODUCT SCAN時，注意小數點後的位數,MRM輸入要準,靈敏度才高
● 先多選幾個離子對，待出現基質幹擾時可換，最後根據法規要求確定離子對數目
● MRM方式優化儀器，通過優化儀器參數，使得母、子離子都達到一定強度水平，使MRM靈敏度最高。可先讓儀器自動優化參數，然後再手動細緻優化，只檢測一對離子時根據TIC的強度來確定儀器參數，一次優化多對離子時，要根據每對離子的XIC強度來分別確定儀器參數
● 先用注射泵優化COMPOUND項下面的參數，如DP、CE及CAD等，再接通LC，用FIA優化其他參數如溫度，氣流和IS電壓及離子源位置，或接一個三通，樣品仍由注射泵進入離子源，同時LC保持需要的流量. 然後進行MRM測定。
● CURTAIN GAS在不降低靈敏度情況下儘量大些，霧化輔助加熱氣流不用太大，這樣可以提高信噪比，保持信號穩定。
● 解析度的選擇：當樣品較純，Q3可選LOW，提高靈敏度，若選LOW後本底噪聲太高則意義不大。
● 色譜柱長度可根據分離的要求而定，定性可長些,定量在能有效排除幹擾情況下儘量短,提高效率；內徑最好選細徑柱如2mm的,1mm的,IS可不分流, 4.6mm柱用1ml流量時如不分流靈敏度還不是最佳,不如流量低時更好。流速高，峰形好
● 不同牌號色譜柱，效果很可能不同
● PH的影響-正離子方式PH要低些，負離子方式PH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形，以至定量誤差。流動相加乙酸銨可適合大部分測定要求
● 用流動相配的標樣，初步優化確定LC條件是否合適
● 標準品工作液現配現做，尤其是較低濃度，時間長了可能因吸附分解等降低
● 進樣順序要先稀後濃
● 洗針液要常換，進過濃樣後要進一針空白，檢驗是否有殘留汙染
● 順序：純樣-添加樣-實際樣品
● 流動相液優化後，空白提取液配製標準再優化，看幹擾，空白添加再提取後看回收率
● 用空白提取液配製標準樣做曲線，準確，有效排除幹擾因素
前處理方法的優化
● LC，MS都優化還不行，改提取方法
● 離子抑制-改變前處理方法或LC條件
● 內標用法，藥代動力學時多採用內標，選擇原則：內標物與被測物的化學性質有區別時，要注意幹擾基質對他們的離子化影響的不同，儘量選同系物。還可利用同位素標記
● 衍生化：有時有助於信號強，且穩定，例如硝基呋喃類，衍生化
後容易測量。
● 最低檢出限，信噪比～3:1，定量限～10:1
● 同一物質幾對離子的比例應相對恆定，誤差不超過15%，峰面積比峰高準確
● 當濃度低，信號弱，自動積分不準時可對峰面積手動積分
● 平滑次數與峰寬因子、保留時間等設置都會影響積分值
● 曲線過零點時，可用4個點；不用，則要5個點
● 線性範圍太寬，有時意義不大
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