第三代測序技術是指單分子測序技術。DNA測序時，不需要經過PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序。
長讀長：定位準確，拼接效率提高，簡化生物信息學處理用「有限」的覆蓋度finishing genome。三代測序的讀長最長可以達到40kb以上。
高精確：99.999% consensus accuracy，此外，三代測序的誤差為隨機誤差，可以通過測序深度自身矯正（當測序深度大於30X左右時，其準確度可以達到99.999%），以及二代數據進行矯正。從下圖可以看出，illumina平臺為系統誤差，錯誤出現在固定的地方（左圖）；而pacbio的誤差為隨機誤差（右圖）。
可以將基因組拼接和甲基化修飾同時進行分析（4-c和6-a）
下圖為SMRT技術鹼基修飾基本原理圖，在上半部分，TCGAT中的A有甲基化修飾，在下半部分，沒有TCGAT中的A沒有甲基化修飾。比較兩者的催化速度圖像，可以看出，甲基化的A導致後一個鹼基T的催化起始時間延長，具體表現為更長的螢光脈衝信號間距持續時間IPD(InterPulse Duration)。
三代測序（Pacbio RS II）是在一個SMRT cell上面進行，每個SMRT cell包含有15萬個 zero-mode waveguides（零模波導孔）。三代測序的上樣方法為磁珠上樣，磁珠連接文庫後，在SMRT cell上進行滾動，滾動過程中連接在磁珠上的文庫會掉入到零模波導孔中（掉進去一條文庫的孔為有效孔，沒有掉進去文庫或者大於一條文庫，則該孔的數據不可用，因此，理論上講有效空的個數為5萬個）。掉入零模波導孔的文庫會與底部的DNA聚合酶和模板結合,4色螢光標記 4 種鹼基（即是dNTP）,在鹼基配對階段,不同鹼基的加入,會發出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的鹼基類型。如果DNA中含有多糖等黏性物質則會影響磁珠的滾動，最終導致測序數據量降低；此外，一些金屬陽離子等可能會影響酶的活性，從而導致測序失敗。因此，三代測序的樣本準備是一個非常關鍵的步驟。
策略：PacBio RS II 平臺+ illumina HiSeq 平臺（3代+2代），測序文庫： 10 kb SMRT bell 文庫
數據量：PacBio RS II 平臺：不低於100X的測序深度；Illumina HiSeq平臺：不少於2G（根據物種的基因組大小而定，如果樣本為真菌，則需要加大數據量）
樣本製備
由於三代測序對樣本DNA的要求比較高，所以在樣本收集這塊給大家以下建議：
1、避免使用複雜或者豐富的培養基進行培養。
2、儘量收集對數早期和對數中期的菌體。
3、進行小體積抽提，避免一次抽提過大體積的樣本。
4、收集菌至 15 mL 離心管中，3,000 rpm，4℃離心後棄上清，用 1.0 mL PBS（或其他符合要求的緩衝液）溶液洗三遍。棄上清保留沉澱。液氮速凍後，-80℃冰箱保存，乾冰運輸。
5、在DNA抽提後一定要對DNA進行純化（可以使用MoBio Power Clean Pro DNA Clean-Up Kit）