一作解讀Microbiome:多維宏組學揭示複雜細菌群落間的相互關係

Microbiome: 應用多維宏組學方法協同揭示複雜細菌群落對目標底物代謝的菌間相互關係

香港大學張彤教授團隊與北京大學餘珂博士研究團隊，以生物降解菌群為研究模型，運用多維宏組學方法（宏基因組、宏轉錄組及目標性代謝組學聯合）解析混合微生物群落內細菌間協同代謝關係。研究成果以「An integrated meta-omics approach reveals substrates involved in synergistic interactions in a bisphenol A (BPA)-degrading microbial community」於2019年2月6日以研究論文（Research Article）的形式在國際微生物學權威期刊Microbiome（IF：9.13）上在線發表。

註：老師是美格合作客戶，在此特祝賀老師取得佳績！背景解讀

微生物相互作用(microbial interaction)是自然生態環境或人造環境的微生物生化過程至關重要的實現方式。理解不同微生物間在生長過程中產生的物質交換（material exchange），可協助研究者理解不同菌種間的競爭或合作關係，有助於發現構建合理的微生物群落所需的關鍵環境因子，對於開發提高複合微生物群落的性能的策略，以及開發監測、預測生物過程的工具至關重要。然而，揭示複雜微生物群落中菌間互作具有挑戰性。因識別在複雜的群落中不同代謝過程中起代謝作用的微生物以及個體的生理特性、代謝能力和活性狀態嚴重依賴於微生物的分離技術，且分離微生物往往難以得到理想效果，以致於細菌相互作用的研究往往難以進行。

多種宏組學（meta-omics）的聯用有可能應用於快速對複雜微生物群落中的菌間關係進行預測，但由於多種宏組學技術聯合使用極其複雜，合理的流程和研究方式有待探討。為了構建準確預測菌間相互關係的宏組學的分析流程，本研究以降解菌群—雙酚A（BPA）微生物降解為研究模型，利用

1). 宏基因組學（metagenomics）恢復菌群中主要微生物的功能潛能以預測其參與的生理過程；

2). 宏轉錄組學(metatranscriptomics)分析特定時期主要細菌的表達譜並推測其在不同階段激活的代謝通路;

3). 目標性代謝組學（targeted metabolomics）以菌群整體為目標檢測在特定時期的代謝產物；並綜合三種宏組學數據的預測結果，

4). 預測不同階段菌間的物質交換以推測相互關係。

而後，以成功分離培養部分主要細菌並以此進行單獨培養（pure culture）及共培養（co-culture），以驗證所預測的菌間相互關係。研究證明，多維宏組學分析比單一宏組學數據更能對微生物群落有更深入和透徹的理解，可準確預測群落內微生物的共生或競爭等關係。

本文建立了一個綜合的多維宏組學的分析體系，成功解譯BPA降解群落中微生物的代謝能力和相互作用。該論文所構建的多維宏組學分析流程不僅適用於環境工程體系中微生物相互關係的預測，同樣對其他自然環境或腸道微生物菌間相互關係的研究有啟示性作用。

綜合宏組學分析流程

本文提供了一種綜合利用多種宏組學數據（宏基因組學，宏轉錄組學，目標代謝組學），並通過分離純菌進行驗證研究混合微生物群落中不同細菌的代謝能力及相互關係的方法（圖1）。關鍵分析流程如下：

1）利用液相雙質譜（LC-MS/MS）檢測中間代謝產物，結合宏基因數據所預測的菌群整體代謝途徑重建BPA降解代謝通路；

2）以16S rRNA 基因分析確定細菌豐度，並利用宏基因組分箱技術（binning）預測優勢物種基因組的代謝潛力；

3）以宏轉錄組數據獲得優勢物種的基因表達譜，預測不同優勢種在特定時期的BPA相關代謝途徑的激活情況，以推測每個物種在BPA降解不同階段中的角色；

4）從富集微生物群落中分離優勢物種驗證從宏組學數據中揭示代謝網絡。

圖1. 本研究中實驗設計和綜合宏組學分析流程

一、代謝產物分析和宏基因功能注釋重建群落水平的代謝通路

對BPA代謝途徑的重構通過兩方面進行：

1). 利用LC-MS/MS檢測BPA及其已知代謝產物在降解過程中的降解行為。表明微生物群落主要通過2種代謝通路對BPA進行降解。而後分別加入BPA的中間代謝產物以解析BPA中間代謝產物的下遊代謝途;

2).由於LC-MS/MS檢測不到任何下遊代謝產物，無法只根據代謝學建立完整的BPA降解通路，故利用宏基因組功能預測結果，重構下遊代謝途徑，以獲得完整的BPA降解途徑（圖2e）。

圖2. 群落水平的BPA降解和代謝通路

二、宏基因組學和宏轉錄組學預測微生物群落中單個微生物在BPA降解不同時期的作用

以BPA為唯一碳源，在BPA降解的四個階段進行DNA樣本、RNA樣本的採集，進行擴增子（16S rRNA基因）、宏基因組及宏轉錄組測序。宏基因組數據組裝獲得組裝重疊群（contigs）並利用binning獲取基因組。使用BLASTp比對NCBI-non-redundant protein sequences, KEGG 及Brenda等多個資料庫預測基因功能。利用GTDB對全基因組序列進行分類注釋。根據基因組完整度、基因功能注釋比例及以16S rRNA 基因測序所獲的物種豐度信息，推測四種具有高完整度基因組的細菌參與了BPA降解，其中包括兩種鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas-1 及Sphingomonas-2 (Sph-2)，一種假單胞桿菌（Pseudomonas）及一種極小單胞菌（Pusillimonas）（圖3）。

圖3. Binning獲得優勢物種的基因組，百分數代表16S基因測序物種豐度

BPA降解過程可被分為4個階段： I階段為接種到未加入BPA前 ；II，III階段分別為BPA加入後2h和14h；IV階段為BPA加入24h後。宏轉錄組數據分析表明有2種主要的表達類型：A型（在第II和第III 階段上調表達，在第IV階段不表達或下調表達）和U型（在第II和第III 階段不表達或下調表達，在第IV階段上調表達）。功能預測的結果顯示Sph-1和Sph-2菌包含轉化BPA為一級代謝產物的基因以及編碼細胞色素P450酶（CYP）的基因，與之前研究的Sphingomonas sp. AO1菌的編碼CYP的基因具有99%的相似性，與編碼鐵氧化還原蛋白的基因具有100%的相似性。同時包含將4-羥基苯甲酸 (4-HBZ) 轉化為草醯乙酸/丙酮酸，將4-羥基苯乙酮（4-HAP）轉化為4-乙醯氧基苯酚（4-HPAT）（圖4）。而負責轉化4-羥基苯乙酮（4-HPAH）和4-HPAT的基因只存在有Sph-1中。在Sph-1和Sph-2中編碼CYP和鐵氧化還原蛋白的基因，以及編碼轉化4-HBZ和三羧酸循環（TCA）的基因均呈現A型表達；相反負責轉化4-HAP為對苯二酚（HQN）的基因hapA和hapB都為U型表達。說明Sph-1和Sph-2在群落中主要負責BPA降解的細菌。

圖4. 涉及BPA降解過程的基因表達以及細菌代謝關係

Pseudomonas 和 Pusillimonas細菌不含有任何初始化降解BPA的基因，卻擁有完整或近完整轉化4-羥基苯甲醛（4-HBD）到琥珀醯輔酶A（succinyl-CoA）的基因和編碼4-HBZ膜轉運蛋白的基因，其基因表達譜呈現整個代謝途徑具備A型表達特徵。Pseudomonas同時含有轉化4-HAP到3-氧代乙二酸（3-ODP）的完整通路，但其表達譜為U型表達。在Pusillimonas菌中的編碼4-HAP降解下遊途徑（HQN轉化為succinyl-CoA）在IV階段為上調表達，提示在最後階段Pusillimonas參與了4-HAP的降解。研究結果還提示該群落中4-HBZ的降解為混合的代謝途徑。

以上綜合分析提出假設：2種Sphingomonas菌負責主要的初始BPA降解，將BPA轉化為包括4-HBZ及4-HAP在內的中間產物。雖Sphingomonas會並進一步將4-HBZ及4-HAP在內的中間產物進行礦化，但菌群中其他主要微生物類群，如Pseudomonas及Pusillimonas等，因可利用BPA代謝的中間產物，且可能具備更強的代謝速度，而與Sphingomonas構成了一個既互利又競爭的微生物群落。

三、細菌分離驗證BPA降解環境中細菌相互關係

使用包含BPA和非選擇性培養基分離Sphingomonas sp.和Pseudomonas sp.。基因組草圖分析與宏基因組數據分離的基因組具有100±0.48%（Sph-2）和100±0.04%的相似性。在批次實驗中，Sph-2單獨培養的環境中，積累表明Sph-2對BPA及諸多初級代謝產物，如1-BP、4-DM的降解是高效的，而對2,4-BP, 3,4-BP 和 4-HPAT的降解是低效的。相反，相較於Sph-2, Pseudomonas sp.可更為高效的利用4-HBZ、4-HBD、4-HAP和4-HPAT等中間產物。這些結果與多維宏組學獲得的基因功能預測結果相符。

當將Sph-2和Pseudomonas sp.混合培養（co-culture）時，BPA的降解速率明顯快於Sph-2單獨培養的的速率。見圖5c，24h後混合培養下TOC的降低了69±0.5%，而單獨Sph-2時之降低了40±0.6%。72h後分別降低84 ± 0.4% 和 77 ± 0.4%。在24h內TOC的快速降解，與1-BP、4-DM、4-HBD、4-HBZ、4-HAP和 4-HPAT的降解相關。在混合培養中，並未檢測到4-DM、4-HBZ和4-HPAT，很大程度是由於Sph-2對4-DM的快速消耗，以及Pseudomonas sp.對4-DM下遊代謝的的降解。同時，Sph-2和Pseudomonas sp. 在24h內均快速增長，Sph-2在單菌培養和與Pseudomonas sp.混合培養在72h內增長量相似（圖5d），表明Pseudomonas sp.消耗了BPA的降解產物，且並未對Sph-2的生長產生影響。

圖5. Sph-2無菌培養(a)和與Pseudomonas sp.混合培養(b)的BPA降解、TOC降低(e)和細菌增長(d)

總結

本研究提供了有效的證據支撐在BPA降解的富集群落中菌間存在的物質交換，並解析其BPA降解體系中菌間相互作用。Sphingomonas sp.可以在維持足夠4-HBD和4-HBZ滿足自身生長需求，但其降解效率低於群落中的其他細菌。而當Pseudomonas sp.存在時，可以同時降解4-HBD、4-HBZ和4-HAP，這一過程加速了Sphingomonas sp.對BPA的初始降解。另一方面，Pusillimonas sp.還參與對4-HAP的下遊代謝產物的降解，可進一步提高整個群落對BPA的礦化效率（圖6）。

該研究表明儘管負責目標代謝物降解過程的微生物非常重要，但是涉及降解其代謝產物的微生物對於整個降解過程同樣有至關重要的促進作用。因此，代謝合作關係比單一的微生物降解更加有利。

在BPA降解混合微生物環境中，LC-MS/MS不能檢測到完整的代謝產物，但將宏組學分析作為補充，可以對複雜的混合生物關係有更加充分的了解。該研究證明了綜合利用宏組學分析可以有效的揭示在群落水平和個體水平的代謝能力和競爭合作關係，多維宏組學與環境依賴型實驗可以有效的揭示闡釋影響降解表現的相互關係。

圖6. BPA混合降解關係簡圖

作者簡介

張彤，香港大學土木工程系教授，香港大學公共衛生學院榮譽教授， 南方科技大學環境科學與工程學院長期訪問傑出教授。長期從事汙水生物處理和環境工程微生物組的科研工作，研究領域包括生物脫氮除磷，新興汙染物的生物降解，汙水中抗生素抗性基因及致病菌檢測等。張彤教授實驗室在環境分子生物學技術和宏基因組學技術等方面積累了豐富經驗。在The ISME Journal，Microbiome，Environmental Science & Technology，Water Research， Bioinformatics等學術期刊上發表相關學術論文200餘篇，其中ESI高被引論文16篇，H指數68 (Google Scholar)，總引用14000次（Google Scholar），並於2018年獲選科睿唯安（（Clarivate Analytics）全球「高被引科學家」。

餘珂，北京大學深圳研究生院環境與能源學院助理教授。主要研究領域包括厭氧菌群、極端環境微生物菌群、腸道微生物菌間互作關係研究及多維宏組學生物信息學方法學構建等。餘珂博士在博士期間受教於張彤教授，曾在生物信息學、分子生物學、環境分析化學及環境毒理學等多個領域的雜誌，包括Microbiome，Environmental Science & Technology， AnalyticaChimicaActa，Toxicological Sciences等學術期刊上發表相關學術論文30餘篇。

Reference

文章主頁：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-019-0634-5

引文：Yu K, Yi S, Li B, Guo F, Peng X, Wang Z, Wu Y, Alvarez-Cohen L, Zhang T. An integrated meta-omics approach reveals substrates involved in synergistic interactions in a bisphenol A (BPA)-degrading microbial community. Microbiome. 2019;7:16.