野生哺乳動物的皮膚和腸道微生物群對環境汙染做出的反應
Skin and gut microbiomes of a wild mammal respond to different environmental cues
譯者：葛德燕 中科院動物所
責編：劉永鑫 中科院遺傳發育所
Microbiome, [9.133]
Published: 26 November 2018
第一作者：Anton Lavrinienko1
合作作者：Eugene Tukalenko1,2, Tapio Mappes3 and Phillip C. Watts1,3
主要完成單位
1 芬蘭奧盧大學生態與遺傳學系 （Department of Ecology and Genetics, University of Oulu, Finland）
2 烏克蘭塔拉斯舍甫琴科國立
基輔大學，生物與醫學研究所（Institute of Biology and Medicine, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Ukraine）
3 芬蘭于韋斯屈萊大學 生物與環境科學系 （Department of Biological and
Environmental Science, University of Jyväskylä，Finland）
劃重點
核輻射汙染是人類健康面臨的巨大威脅之一，然而，怎麼量化這種汙染對生物有機體的影響呢？今天推薦閱讀的這篇文章給我們樹立了非常好的研究案例。文章作者通過研究烏克蘭車諾比核電站4號機組反應堆爆炸留下的核禁區對堤岸田鼠皮膚和腸道微生物群產生的影響，發現核汙染可能會使受汙染影響的棲息地微生物群落趨於均勻。相關研究成果分為兩篇論文分別以這種田鼠的皮毛菌群和腸道菌群為討論重點。此篇重點討論皮毛菌群。關於腸道菌群的研究請見Lavrinienko et al 2018. Environmental radiation alters the gut microbiome of the bank voleMyodes glareolus. The ISME Journal. 2018;12:2801–2806.
熱心腸日報
輻射及地理位置對田鼠皮膚及腸道菌群的影響
創作：沈志勳 審核：沈志勳 2018年12月04日
原標題：野生哺乳動物的皮膚及腸道菌群對不同環境因素的應答
對車諾比隔離區（CEZ）之內及之外的堤岸田鼠的皮膚及腸道菌群進行分析對比；
雄性田鼠的皮膚菌群多樣性高於雌性田鼠，而CEZ內部的田鼠的皮膚菌群α多樣性更高；
相比於CEZ外部的田鼠，CEZ內部的田鼠的皮膚菌群群落表現出更高的相似度，而地理區域對田鼠皮膚菌群的影響大於輻射；
與皮膚菌群不同，田鼠的腸道菌群群落結構與接受輻射的水平顯著相關，且輻射的影響大於地理區域。
主編評語：Microbiome上發表的一項最新研究，對比了車諾比隔離區內外的河堤田鼠的皮膚及腸道菌群，發現皮膚菌群更多地受到地理區域的影響，而核輻射更多地影響了腸道菌群。
摘要
Background
動物皮膚和腸道微生物群落是宿主健康的重要組成部分。然而，對形成野生動物微生物群落的過程知之甚少，特別是在接觸環境汙染物方面。研究者使用16S rRNA擴增子測序來量化暴露於放射性核素對一種小型哺乳動物——堤岸田鼠（bank vole）的皮膚和腸道微生物群的影響。Myodes glareolus， 這種田鼠群居在烏克蘭車諾比禁區 （Chernobyl Exclusion Zone， CEZ）內外。
（此圖片來源於網絡）連結：http://img3.cache.netease.com/photo/0009/2017-04-26/CIUU2IDC724Q0009.jpg
譯者註：1986年4月26日，烏克蘭車諾比核電站4號機組反應堆爆炸，數百萬人受輻射影響，釀成迄今為止世界最嚴重的核洩漏事故。
結果
Results
雄性堤岸田鼠的皮膚微生物群落多樣性高於雌性。然而，皮膚微生物群更大的差異發生在更大的空間尺度上，在CEZ區域內，不管是否受到放射性核汙染，堤岸田鼠的皮膚微生物群落與CEZ外未受汙染的區域相比具有較高的alpha多樣性。同樣，不管受到核汙染的程度如何，皮膚微生物群落(beta多樣性)在CEZ內表現出比在基輔附近區域更大的相似性。因此，與土壤放射性核素水平相比，這種田鼠皮膚微生物群落的結構更多地受地理因素的影響。這一模式與這種田鼠腸道微生物群組成形成了鮮明對比，在這些地方，微生物群落在距離較遠(約80公裡)、未受汙染的地方可能驚人地相似，而且微生物群落結構的差異與放射性水平有關。我們還發現，同一個體的皮膚和腸道微生物群落的相似與否取決於暴露於放射性核素的潛在風險。
結論
Conclusions
堤岸田鼠的皮膚和腸道微生物群落對相似的環境信號有不同的反應，因此在不同的空間尺度上有不同的結構特徵。我們的研究表明暴露於環境汙染如何影響哺乳動物宿主的皮膚和腸道微生物群落之間的關係，可能會使受汙染影響的棲息地的微生物群落趨於均勻。
關鍵詞
Keywords
人為影響，生物多樣性，電離輻射，汙染，皮膚微生物群，野生哺乳動物
前言
Background
動物皮膚(skin, SK)和胃腸道(gastrointestinal tracts, GI)承載著多種微生物群落(microbiomes)，它們對宿主的健康非常重要。SK和GI微生物群落的組成可以通過以下作用影響宿主的健康:(1)形成屏障，防止病原體的入侵;(2)幫助訓練免疫系統;(3)調控炎症；而GI微生物群還能(4)通過發酵提供能量和其他重要的代謝物，否則難以完成消化食物的任務。因此，了解引起微生物群落組成變化的過程，以及個體在特定環境下微生物群落表現出的共存尺度（concomitant scale）是很重要的。
人類SK菌群的組成可能受到地理位置、特定生境暴露、個體和體位（body site）、宿主年齡和性別等因素的影響。動物SK菌群的研究較少，但地理、環境、身體部位，以及圈養狀態決定了動物SK菌群的數量和組成。GI微生物群落還受地理、寄主年齡和環境等因素的影響，但寄主飲食在塑造人類和動物的微生物群落方面具有明顯的作用。
儘管許多研究報告了SK和GI微生物群落對宿主健康的重要作用，但這些群落通常是相互獨立進行研究的。因此，個體宿主的SK和GI微生物群落之間的潛在關係尚未(或缺乏)在野生動物(或確實在家養、實驗室動物或人類)中建立。由於個體的微生物群落來自於環境，因此宿主上不同微生物群落之間存在一定程度的相似性。然而，SK和GI微生物群落的最終組成至少反映了它們在各自不同生態位中的選擇。例如，皮膚是乾燥和需氧的，營養成分稀少，pH值、紫外線照射、溫度和皮脂含量各不相同。而結腸是潮溼和厭氧的，溫度穩定，富含宿主食物的營養。因此，健康個體的SK和GI微生物群落可能是不同的。由於對來自同一個體的GI和SK微生物群進行明確比較的情況很少，因此這些微生物群是否會在相同的空間尺度上對相似的環境誘因做出反應，這在很大程度上是未知的。鑑於皮膚及其微生物群與環境直接接觸，可以預測SK微生物群的變化反映了環境的多樣性。相比之下,GI微生物群受宿主飲食的強烈影響，其與更廣闊的環境之間的關係並不總是直接的。
考慮到人類對環境的廣泛影響，可以想像SK和GI微生物群落都是由人類活動的類型決定的。例如，暴露於各種化學物質、重金屬或電離輻射可改變實驗鼠的胃腸道微生物群。大多數環境汙染物對SK菌群的影響尚不清楚，但預計會改變SK菌群的多樣性和組成。然而，令人驚訝的是，很少有研究量化了人為棲息地的改變如何影響野生動物的微生物群落組成。據我們所知，在實驗室或野生哺乳動物中暴露於環境汙染物對SK菌群的影響尚未得到研究。
放射性核汙染是人類和野生動物遺傳毒性（genotoxicity）的潛在來源，人類活動導致放射性核素釋放到環境中，在世界各地留下許多長期受汙染的地區。值得注意的是，1986年車諾比核電站Chernobyl Nuclear Power Plant， CNPP） 4號反應堆發生爆炸，在烏克蘭、白俄羅斯、俄羅斯和歐洲部分地區釋放了大量的放射性核素。CNPP周圍的放射性核素，如鍶-90(-90S)、銫-137 (137Cs)和鈽-239 (239Pu)水平持續升高，而鄰近區域(半徑約30公裡)以車諾比禁區的形式限制了人類進入(CEZ)。居住在CEZ的野生動物為研究暴露於環境核輻射汙染的生物提供了最好的研究模型。
CEZ內的環境受到持續的放射性核素汙染的影響，長期暴露於由這些汙染物產生的電離輻射中。這些汙染物對生物體有不同的影響，例如對無脊椎動物群的豐度和多樣性、鳥類群落和哺乳動物的密度均產生了負面影響。相反，有證據表明，暴露於高水平的放射性核素對大型動物的密度幾乎沒有影響。同樣，對微生物群落組成的研究也得到了相互矛盾的結果，即在輻射對群落多樣性和豐度的影響方面結論不一致。例如，研究者們對定居於CEZ汙染地區的自由生活微生物的多樣性與未汙染區域相比得出明顯減少、相似或更多樣化，各自不同的結論。來自受汙染區域的鳥類羽毛細菌群落與未汙染區域相比有降低的趨勢(2.9μSv / h)。在小型哺乳動物中，暴露於CEZ內的環境放射性核素改變了GI微生物群的組成，但沒有改變群落的多樣性(堤岸田鼠)。目前還沒有一項研究量化暴露於環境放射性核素對野生哺乳動物SK微生物群的影響。
此項研究的目的是(1)量化環境輻射對一種小型哺乳動物SK微生物群(bank vole,Myodes glareolus)的影響，並(2)直接比較SK和GI微生物群適應環境的變化。為了實現這些目標，我們分析了從CEZ內和CEZ外的放射性汙染區以及控制區(放射性核素水平沒有升高)內收集的動物皮毛拭子和糞便樣本。我們預測堤岸田鼠SK菌群對輻射暴露很敏感，類似於GI菌群的效應，SK菌群在更大的空間尺度上有所不同，反映了環境的變化。我們也期望相同個體的SK和GI的微生物群落高度不同，這與它們不同的生態位相一致。
方法
Methods
堤岸田鼠誘捕與研究設計
Bank vole trapping and study design
堤岸田鼠用於研究野外暴露於放射性核素的影響是一種理想的哺乳動物模型。主要原因有以下幾點：
這一物種在CEZ內部和外部都很常見，
堤岸田鼠吃受汙染的食物，生活在土壤表面和內部，在那裡它們會經歷相當強的汙染(即> 10 mGy/d)吸收輻射劑量;
作為一種小型齧齒動物，它的家域範圍相對較小(0.7-0.8 ha)，擴散能力有限，在繁殖季節最高可達1公裡)，因此這些動物的外部輻射暴露反映了它們捕獲地點的環境輻射劑量。
後一點很重要，因為CEZ內的放射性核素汙染是鑲嵌在一起的，受汙染和相對未受汙染的地區可相隔約1.5公裡。
2016年5月25日至6月19日期間，在烏克蘭北部的70個捕鼠點捕獲了田鼠。 每個地方都有16個Ugglan 2號專用陷阱(Grahnab, Sweden)置於4×4的網格中，陷阱間距離為20 m。每一個地點的誘捕期為連續三個晚上。 在下午晚些時候設置陷阱，第二天一早收集動物。用蓋格-穆勒劑量計(Geiger–Mueller dosimeter)在離地面1釐米的地方測量了所有捕獲點的土壤輻射水平。
採樣點設置在三個區域，CH, CL 和KL， 以對比分離的空間環境中核輻射水平不同對動物造成的影響(圖1)。 在這三個取樣區，又分別設計了2-3個重複取樣地(CH1, 2，3, CL1, 2 和 KL1, 2)，以控制除了核輻射水平不同之外的其它環境因子，如：棲息地的差異。三個研究領域因此代表兩种放射性核素汙染不同的環境: 1)高(CH1,均值= 30.5μGy/h;輻射劑量範圍,10 - 198.7 μGy/h)和 (2)低(CL,均值= 0.26 μGy/h;輻射劑量範圍, 0.12 -0.55μGy/h,KL,均值= 0.31μGy / h; 輻射劑量範圍 0.15-0.55μGy/h)。值得注意的是，CH站點包含顯著高於CL和KL的輻射值(bonferroni校正的Kruskal-Wallis檢驗，df = 2χ2 = 115.4, P
圖1. 以點表示的堤岸田鼠捕獲地點所在研究區域地圖。圖中顯示了每個區域(例如CH1-3、CL1-2和KL1-2)內的重複站點，其中包括CEZ內的受汙染區域(CH)和未受汙染區域(CL)以及烏克蘭基輔附近的未受汙染區域(KL)。顏色的點表示環境輻射水平的差異, CH,紅色(10 - 198.7μGy / h); CL,綠色(0.12 - -0.55μGy / h)和KL、綠色(0.15 - -0.55μGy / h)。虛線表示CEZ(面積~ 2050 km2)周圍的邊界。圖是使用R中的ggmap v.2.6.1包創建的。
Fig 1. Map of the study areas with bank vole trapping locations shown by points. Replicate sites within each area (e.g. CH1-3, CL1-2 and KL1-2) are shown, with areas contaminated (CH) and uncontaminated (CL) with radionuclides within the Chernobyl Exclusion Zone (CEZ) and uncontaminated area near Kyiv (KL), Ukraine. Colour of the point indicates differences in environmental radiation levels, CH, red (10–198.7 μGy/h); CL, green (0.12–0.55 μGy/h) and KL, green (0.15–0.55 μGy/h). Dashed line represent the border around the CEZ (area of ~ 2050 km2). Figure was created using ggmap v.2.6.1 package in R.
放射量測定
Dosimetry
我們使用γ-spectrometry （γ-光譜測定法）來估算整隻堤岸田鼠積累的放射性核素(137Cs負荷) 。堤岸田鼠體內137Cs活性(n = 123，代表所有研究區域)使用SAM 940放射性核素識別系統(Berkeley Nucleonics Corporation, San Rafael, CA, USA) 配備NaI檢測器進行測量。 估計137Cs的負荷有所不同，從103.3到11,678,418.6 Bq/kg。居住在CH的動物與CL和KL的動物所受輻射劑量平均差異超過兩個數量級(>高140倍)。因此，來自CH的田鼠所受輻射顯著(χ2 = 66.01, df = 2, P
研究者們還估算了外界環境對研究中的田鼠輻射量。外部輻射劑量變化從0.10 mGy到286.13 mGy，CH平均值在55.66 mGy左右，CL和KL分別為0.42和0.45 mGy。與137Cs活動類似，動物在CH經歷顯著高於(χ2 = 65.96, df = 2, P
拭子樣本採集
Swab sample collection
用棉籤拭取堤岸田鼠毛皮，對SK微生物進行了菌群採樣(Epicentre Biotechnologies, Madison, USA)。採樣時，拭子緊緊地壓在胸背部，來回擦拭20次，然後立刻放入該款包含750μL緩衝溶液的MoBio動力珠管(MoBio Power Bead，卡爾斯巴德，美國)，並在DNA提取前將其保存於- 80℃(n總共取樣157，其中CH n = 66, CL n = 44, KL n = 47)。為避免潛在的批次效應和系統偏差，樣品從每一處理組進行處理都是隨機的(如儲存、運輸，DNA提取，文庫構建和測序)。本研究中的動物一律使用非侵入性取樣，這也是另一項研究的一部分(Kivisaari等人未發表數據)，他們被安置在CEZ內的野外實驗室，在單獨的Makrolon III型籠中(43×26×15釐米)，並為它們提供鋸末和乾草以便它們做巢。提供食物(RM1，特殊的飲食服務)和飲用水。對動物的體長和頭寬、體重進行測量，並精確到0.1mm或者0.1g。懷孕的雌性在她們生產後再測量。體重經常被用作一個指示年齡的指標，然而，很多因素會影響體重，例如母鼠的妊娠狀況。因此，本研究按頭寬將這些田鼠分為三個年齡組:幼體(~ 1 月，11.6-12毫米)和，亞成體 (~ 2 ~ 5個月，12.1 ~ 13.4mm），成體 > 10個月，>13.5mm。基於視覺的性別評估 (雄性63例，雌性94例， 即雄性、妊娠期、哺乳期或哺乳期的睪丸下降女性陰道穿孔的存在)結合測量數據，排除非常年幼的個體(~ 1 - 2周大)。
DNA提取和16S rRNA基因測序
DNA extraction and 16S rRNA gene sequencing
使用PowerSoil DNA抽取試劑盒(MoBio
Laboratories, Carlsbad, USA)從棉籤樣本中提取DNA (n = 157) 。16S rRNA基因的擴增和文庫構建由芬蘭分子醫學研究所負責完成(FIMM, University of Helsinki)(www.fimm.fi)。 簡單地說，16S rRNA基因的V4區域經多重擴增。PCR反應採用515F/806R 引物並附帶個體鑑定標籤進行。PCR條件為如下: 98°C持續30秒，然後在98°C循環27次， 10秒，56°C 30秒，72°C 15秒然後72°C延伸10分鐘。PCR產物體積相等，並純化兩次(AMPure XP PCR Purification kit)，使用0.8倍於純化體積的磁珠進行純化。最後文庫是否使用需要用安捷倫高靈敏度DNA試劑盒（Agilent High Sensitivity DNA
Kit）在安捷倫2100生物分析儀進行測定 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) 。16S擴增子在Illumina
MiSeq上使用PE250進行雙端測序。
數據處理
Read data processing
採用FIMM依據標籤序列對測序數據進行拆分為單個樣本（de-multiplexed）。接頭序列（adaptor）在PE模式下使用 TRIMMOMATIC v.0.35去除。 雙端序列合併使用PEAR v.0.9.1裝，並指定最短(-n290)和最長(- m294)的序列長度。經這些處理後留下8,012,677條序列，平均每樣品有51,036條(範圍= 36-247,393) ，進而使用QIIME v.1.9.1處理。 潛在的嵌合序列用UCHIME進行去除，保留下來的(無嵌合體)的數據使用SORTMERNA
和SUMACLUSTS進行半有考(Open-reference)可操作分類單元(OTUs)的預測。參考Greengene資料庫，按97%相似原則對細菌進行分類。低豐度的OTUs被刪除(核心組成是由存在於所有151個個體中的OTUs所定義的。最後 SK的微生物組分析代表1928個OTUs(平均值為在901 OTUs/樣本範圍內，範圍= 562-1200 OTUs/樣本)。
統計分析
Statistical analyses
除特殊說明外，採用R v.3.3.3進行統計分析。研究區域間菌群組成的alpha值的顯著差異(豐富度-觀測到的OTUs數量;均勻度, 香農指數)和群落組成使用Kruskal-Wallis確定，然後使用DUNN.TEST包進行Dunn’s事後檢驗和 Benjamini–Hochberg FDR或者 Bonferroni 校正多重分析。我們也完成了Spearman’s rank
相關分析，以檢查 (1)外照射劑量(2)137Cs 全身負荷和庫田鼠SK菌群alpha多樣性之間的潛在聯繫。
我們利用廣義線性模型來確定影響SK微生物群落多樣性的潛在預測因子(GLM)。完整模型中包含的解釋變量包括性別(雄性|雌性)、體重、頭部寬度(代表年齡)、研究區域(CH, CL和KL)和通過宿主性別交互作用研究區域(*)。模型選擇基於Akaike信息準則(AIC)進行了調整，並使用AICc對模型進行排序，以確定樣本大小。 兩個AICc中最簡約的模型中AICc值最低的那一個被認為是支持相關的最佳模型。利用MUMIN v.1.15.6中的DREDGE函數進行模型選擇。
Beta多樣性是利用Bray–Curtis差異矩陣和未加權UniFrac距離來估計樣本之間的差異（Bray–Curtis dissimilarities and unweighted UniFrac distances），由PHYLOSEQ v.1.19.1計算。樣品間的差異用主坐標分析(PCoA)，並採用置換方差分析( PERMANOVA)進行統計學檢驗， 這些檢驗由VEGAN v.2.4-2中的ADONIS函數實現。
採用隨機森林機器學習分類方法，根據微生物群落組成確定堤岸田鼠SK菌群定位的準確性。模型使用RANDOMFOREST在QIIME v.1.9.1中實現，每個模型有1000棵樹和10倍交叉驗證誤差估計。模型檢驗了來自CEZ內外的堤岸田鼠SK微生物群分配成功率，即（1）受汙染組和未受汙染組之間的對比；（2）三個研究區域(CH、CL和KL)之間的對比；(3)所有七個研究區域之間的對比；也就是重複取樣地的對比。
結果
Results
堤岸田鼠皮膚微生物組成
Bank vole SK microbiome composition
利用16S rRNA基因測序技術，對157隻野生捕獲岸田鼠的SK菌群進行了定性分析，這些田鼠來自環境放射性核素汙染水平不同的地區(圖1)。鑑定出來自15個細菌不同門的1928個OTU。變形桿菌(34%)，厚壁菌門(28%)，放線菌(16%)、擬桿菌門(16%)和藍藻門(4%)，這五個類群佔據了97%的豐富度。變形菌門中的丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）佔據主要優勢（20%），其次是放線菌，梭狀芽胞桿菌，桿菌豐度大致相同（14%）。這種群落組成可與其他非人類哺乳動物的SK微生物群相媲美。這種田鼠SK微生物群由乳桿菌屬節桿菌、葡萄球菌、不動桿菌、以及藍藻OTUs組成核心成員。由於幾乎所有的OTUs都不局限於一個研究區域，微生物類群豐度的變化導致SK菌群多樣性和群落結構的空間差異如下。
圖2. 測定居住在環境輻射水平不同地區的田鼠皮膚微生物群的alpha多樣性。箱線圖表示alpha多樣性估計的中值和四分位數範圍(即觀察到的OTUs數量、Shannon指數)。每個方框圖代表一個來自受汙染區域(CH1-3)和未受汙染區域(CL1-2)的實驗重複站點，其中放射性核素區域排除CEZ烏克蘭基輔(KL1-2)附近的區域和未受汙染地區。
Fig. 2 Measures of alpha diversity for the skin microbiome of bank voles inhabiting areas that differ in levels of environmental radiation. Box-andwhisker plots represent the median and interquartile range of alpha diversity estimates (i.e. number of observed OTUs, Shannon index). Each box plot represent a replicate site from contaminated (CH1-3) and uncontaminated (CL1-2) with radionuclides areas within the Chernobyl Exclusion Zone and uncontaminated area near Kyiv (KL1-2), Ukraine
SK菌群組成的alpha和beta多樣性
Variation in SK microbiome alpha and beta diversity
SK菌群的alpha多樣性受性別和地理位置的影響，卻不受核輻射汙染的影響。外部受輻射的劑量和全身承載的137Cs輻射都與SK菌群不呈顯著的相關關係。而受汙染區內的兩個樣地（CEZ內）的alpha多樣性顯著高於CEZ區域外的樣地（圖2）。我們還注意到同一區域內兩個重複樣地之間SK菌群存在較大的變異，如來自紅森林（Red Forest）及其臨近區域的樣本具有較多的特有OTUs。無論是體重還是頭部寬度(年齡的代用指標)都與SK菌群alpha多樣性無關。有趣的是，雄性田鼠的alpha多樣性(OTUs和Shannon指數)顯著高於雌性(P
SK微生物群落結構的變異強化了alpha多樣性的格局。來自CH和CL的田鼠SK微生物組樣品具有明顯重疊的成簇特徵，這些簇主要在第二個PCoA軸上與KL樣品分離（圖3）。因此，田鼠 SK微生物群落在研究區域間存在顯著差異(P = 0.001, PERMANOVA)，來自CEZ內部或外部的樣本來源基於分類單元豐度(Bray-Curtis dissimilarity)和群落成員間的系統發育距離(未加權的UniFrac)，是SK微生物群beta多樣性的主要預測因子。
值得注意的是，基於外部輻射劑量和全身137Cs放射性核素負荷，輻射對SK微生物群落結構沒有顯著的預測作用(P > 0.05, PERMANOVA)。與故意的非均勻採樣一致，我們觀察到顯著性
(P = 0.001, PERMANOVA)複製位點和這個分組之間beta多樣性的差異佔未加權變異的13%和17%UniFrac距離和Bray-Curtis不相似矩陣。 與alpha多樣性相似，寄主性別對beta多樣性的總變異有顯著的貢獻(P
(CEZ內、外)、田鼠誘捕位點和寄主性別是庫田鼠群落結構和多樣性的主要預測因子，環境放射性核素對其影響不顯著。
圖3. 與環境輻射暴露相關的堤岸田鼠皮膚微生物組beta多樣性差異。基於Bray-Curtis距離的PCoA，在三個研究區域中對田鼠皮膚微生物群譜的差異距離進行了研究。每個點代表一個樣本(n = 151)，形狀代表寄主性別，按研究區域著色: CH，紅色(n = 64); CL，藍色(n = 44); KL，綠色(n = 43)。 橢圓表示圍繞聚類質心的95%置信區間(CI)。
Fig. 3. Differences in bank vole skin microbiome beta diversity associated with environmental radiation exposure. PCoA on Bray–Curtis dissimilarity distances between bank vole skin microbiome profiles among the three study areas. Each point represents a single sample (n = 151), shape indicate host sex, coloured according to study area: CH, red (n = 64); CL, blue (n = 44); KL, green (n = 43). Ellipses represent a 95% CI around the cluster centroid.
基於SK菌群組成預測田鼠的來源
Bank vole origin can be predicted from SK microbiome community composition
隨機森林學習進一步支持了地理位置而不是環境放射性核素水平影響田鼠SK微生物組組成。隨機森林模型正確地分類了來自內部(CH和CL)和外部的樣本(KL) CEZ的94% (SD =5%)的時間;這一精度比隨機預測的精度高出4.8倍左右。 而來自CEZ的107個樣本中只有一個被歸類為KL。 該分類方法能夠正確地將樣本分配到三個研究區域(均值)
= 80%，±SD 11%)和7個複製位點(75±9%)，但模型錯誤率較低(分別為2.8和3)
(對隨機森林分類器的估計泛化誤差進行隨機猜測時的基線誤差)。這種預測準確性的下降是由於CEZ中CL和CH SK微生物群的相似性造成的。例如， CL1中只有不到17%的樣本被正確分配，而是被歸類為CH1(56%)或CH2(22%)。因此，來自CL的複製的高類錯誤表明，模型無法確定樣本是否來自於
CEZ(附加文件11)，儘管意義重大(參見
上述「方法」部分)居住在這些地區的動物的外部輻射暴露水平和內部放射性核素負擔的差異。
圖4. 與環境輻射暴露相關的腸道和皮膚微生物組beta多樣性差異。在三個研究區域中，Bray-Curtis與堤岸田鼠(a)腸道和(b)皮膚微生物群剖面之間的距離不同。每個點代表一個樣本(n = 93)，形狀代表寄主性別，按研究區域著色: CH，紅色(n = 36); CL，藍色(n = 28); KL，綠色(n =29)橢圓表示每個研究區域複製位置的聚類質心周圍75%的CI。(c)腸道和(d)皮膚微生物群落差異與地理d的相關性。採用Mantel檢驗相關顯著性; 直線表示線性回歸模型。
Fig. 4 Differences in gut and skin microbiome beta diversity associated with environmental radiation exposure. PCoA on Bray–Curtis dissimilarity distances between bank vole (a) gut and (b) skin microbiomes profiles among the three study areas. Each point represents a single sample (n = 93), shape indicate host sex, coloured according to study area: CH, red (n = 36); CL, blue (n = 28); KL, green (n = 29). Ellipses represent a 75% CI around the cluster centroid for each study area replicate site. Correlation between (c) gut and (d) skin microbiome communities dissimilarity and geographical distance (km) among bank vole trapping locations. The correlation significance was tested using Mantel tests; lines denote the linear regression model.
比較SK與GI菌群的差異
Comparative analysis of the SK and GI microbiomes
堤岸田鼠SK和GI微生物群落對不同的環境誘因有明顯的反應，因此它們的結構在不同的空間尺度上形成（圖4）。因此，地理位置決定了SK菌群alpha和beta多樣性的顯著差異，這與GI菌群的群落組成和多樣性形成了明顯的對比，其alpha和beta多樣性是由放射性核素汙染程度而不是地理位置決定的。因此，雖然三個研究區GI微生物組的alpha多樣性(豐富度和均勻度)差異不顯著(P > 0.05, Kruskal-Wallis檢驗)(且定量上KL較高)，但相比較SK微生物組alpha多樣性在CEZ區域內顯著較高。此外，SK和GI微生物群落均表現出明顯的不同聚類(P 圖4a,b)，來自CEZ的SK微生物組樣本(即來自CEZ的樣本)有明顯的重疊)，而GI微生物組樣本則是根據放射性核素水平聚集在一起的(即，儘管這些位置之間的距離約為80公裡，但CL和KL之間重疊最多）。
隨著田鼠誘捕地點之間地理距離的增加，堤岸田鼠SK菌群之間的差異越來越大(r = 0.241, P = 0.001，Bray-Curtis;r = 0.222, P = 0.001未加權的UniFrac, Mantel test，圖4d)，進一步增強了空間距離對SK菌群的貢獻。相比之下，GI微生物群落的相似性相對較弱，如果有的話，這與樣本之間的距離有關(r = 0.087, P = 0.011 for Bray–Curtis; r = 0.016, P = 0.706 for unweighted UniFrac, Mantel test,Fig. 4c)。在CEZ中，我們發現GI微生物群的群落差異與地理距離顯著正相關(r = 0.163，僅Bray-Curtis Mantel檢驗P = 0.001 (SK微生物組，r = 0.071, Bray-Curtis Mantel檢驗P = 0.121)。
考慮到CEZ內不同區域GI微生物群的差異是由細菌OTUs的豐度變化而不是分類單元替代引起的，因此使用未加權的分析結果並不令人驚訝。UniFrac作為距離度量對SK和GI菌群均不顯著(r = 0.072, P = 0.155, r = 0.065, P = 0.267, Mantel test)。有趣的是，暴露於土壤放射性核素(或潛在暴露於土壤放射性核素)與SK和GI微生物群的不同程度的梯度有關:KL最高，CL為中間值，CH最低。最後，隨機森林模型對SK和GI微生物群落具有相似的預測精度(分別為77%和80%)。但是，該分析不能可靠地區分CL和CH的SK菌群，也不能區分CL和KL的GIL菌群(圖6)。這進一步導致CL(圖6)個體的類誤差估計不斷升高，CL傾向於與CH或KL結合，這取決於微生物群的取樣來源。
圖5. 每個研究區域內GI和SK微生物群落的差異性。箱線圖表示樣本間Bray–Curtis距離的中值和四分位數範圍。每個方框表示CEZ區域汙染(CH)和未汙染(CL)樣地與烏克蘭基輔附近的區域的對比。
Fig. 5 Community dissimilarity between gut and skin microbiomes within each study area. Box-and-whisker plots represent the median and interquartile range of Bray–Curtis distance between samples. Each box plot represent contaminated (CH) and uncontaminated (CL) with radionuclides study areas within the Chernobyl Exclusion Zone and uncontaminated area near Kyiv (KL), Ukraine.
圖6. 使用隨機森林分類對來自CEZ受汙染區(CH)與非汙染區(CL)以及烏克蘭基普附近（KL）堤岸田鼠的SK和GI進行對比分析。a. RF分析的混淆矩陣的每一行表示研究區域，顏色強度表示組內一致性，對應分類器預測的樣本佔每一列指定研究區域的比例。b.分類誤差估計表明每個研究區域的完整性，給出了皮膚和腸道微生物群落分析。
Fig. 6 Random forest (RF) classification of skin and gut microbiomes associated with bank voles inhabiting areas contaminated (CH) and uncontaminated (CL) with radionuclides within the Chernobyl Exclusion Zone and uncontaminated area near Kyiv (KL), Ukraine.aEach row of the confusion matrix from RF analysis represent the study area, the colour intensity indicates within-group coherence and correspond to the fraction of samples that were predicted by the classifier to belong to the study area specified by each column.bClass error estimates indicate the integrity of each study area given the skin and gut microbial communities analysed.
討論
Discussion
雖然來自皮膚(SK)和胃腸道(GI)的微生物群落對宿主健康有著不同的影響，但對野生動物群落結構和多樣性的形成過程卻知之甚少，尤其是在人為棲息地影響方面。本文首次分析了哺乳動物SK菌群對環境放射性核素汙染的反應，並對SK菌群與GI菌群的差異進行了比較。與我們的預測相反，接觸放射性核素對田鼠SK菌群影響較小; 相反，居住在CEZ的田鼠比來自CEZ之外的田鼠具有更高的SK微生物群多樣性。在個體水平上，雄性岸田鼠有較高的SK微生物多樣性。最後，SK和GI菌群對環境的反應不同，SK菌群的形成更多地受地理位置的影響，而GI菌群則受放射性核素水平局部變化的影響。
堤岸田鼠的SK菌群是多種多樣的，其群落結構與其他非人類哺乳動物，尤其是齧齒動物的基本相似。例如，類似於我們對堤岸田鼠的數據，變形菌，放線菌和桿菌是其他齧齒動物SK菌群的優勢菌綱，包括松鼠（Sciurus carolinensis），土撥鼠（Marmota monax)，以及蝙蝠和家犬。 在這些微生物綱級單元中，來自Acinetobacter, Staphylococcus (S. succinus), Lactobacillus ，Pseudomonasgenera 屬的成員與堤岸田鼠以及人類和其他哺乳動物的SK菌群有關; 高度普遍性(即在所有樣本中均發現)和豐度(即在最豐度前10屬內)表明它們是堤岸田鼠SK菌群的核心組成成員: 確定這些細菌在堤岸田鼠SK菌群中的功能作用是未來研究的一個方向。
環境對SK菌群的影響
Environment effects on SK microbiome
大多數針對非人類哺乳動物的SK微生物群研究都是在圈養動物身上進行的，只有少數研究考察了自然界中哺乳動物中的SK微生物群。因此，我們對環境和宿主特性的貢獻知之甚少，例如，性別在塑造野生哺乳動物SK微生物群落中的作用。我們的研究結果與常見的自由生活細菌(例如，土壤相關細菌)的發生是一致的。因此，野生齧齒動物的SK菌群主要受相對較大空間尺度(~ 80 km，距離河岸最小距離)環境變化的影響。
寄主對SK菌群的特有影響
Host-specific effects on SK microbiome
值得注意的是，關於寄主特徵(如性別)對野生動物SK微生物群落組成的影響，我們知之甚少。在堤岸田鼠中，頭部寬度或身體重量的變化(例如，反映年齡或生長的差異)對SK微生物群落多樣性幾乎沒有影響，但寄主性別很重要。性別偏向的微生物群落差異很少報導，儘管SK微生物群落的多樣性在人類女性中高於男性。儘管如此，性別是紅袋鼠SK菌群的重要預測因子，但對貓、狗和馬(主要是家養或圈養動物)卻沒有影響。乳酸菌（Lactobacillus）在母鼠SK菌群的的雙倍增減與人類一致。乳酸菌屬的成員支配陰道微生物群，在雌性SK菌群中含量較高。性別差異導致SK菌群存在差異可能是一種普遍現象。SK菌群的性別差異也可能反映了影響環境類型的行為差異，從而影響所經歷的微生物群。例如，作為許多哺乳動物的典型，雄性田鼠傾向於更多地去覓食或尋找配偶。更大的活動可能為雄性田鼠提供機會使它們獲得更多樣化的微生物群，例如，類似於生活方式(例如，在室內或室外呆的時間;居住在農村或城市環境中的;暴露於自然生物多樣性)對動物和人類SK微生物多樣性具明顯影響。
暴露於放射性核素汙染的影響
Effect of exposure to radionuclide contamination
雖然人類活動改變生境對生物多樣性產生了廣泛的負面影響，但暴露於環境放射性核素汙染並不一定會減少微生物的多樣性。這可能很奇怪，因為SK微生物群落主要來自於環境，而對生物多樣性有負面影響的過程預計會對SK微生物群產生伴隨影響。 與KL相比，CEZ中SK菌群的多樣性較高，這與無脊椎動物的研究形成了對比和微生物群落暴露於車諾比放射性塵降物中，其中放射性核素水平升高對生物多樣性有負面或沒有影響。與我們的研究結果相似，紅森林中放射性廢物處理溝槽內的土壤微生物多樣性要高於周邊區域。森林凋落物在CEZ內的汙染區域(包括紅森林)累積，考慮到堤岸田鼠居住在洞穴中並在凋落物周圍活動，這可能增加了其獲取微生物群落的可用微生物生態位空間。奇怪的是，在CEZ內受汙染地區森林垃圾的積累意味著微生物分解者或土壤無脊椎動物的功能受損。因此，CEZ內的高SK微生物群多樣性(以及周圍環境中的高微生物多樣性)似乎與健康的生態系統功能無關。物種多樣性估計沒有考慮到物種對生態系統服務的生態作用和不同貢獻。
SK微生物群是動物生活的重要組成部分，紅色森林(CH1)和鄰近地區的獨特OTU數量最高(圖2)，這可能反映了與放射性核素暴露相關的高突變率。雖然SK微生物群alpha多樣性與居住在這些地區的動物的外部輻射劑量或內部放射性核素(137Cs)負荷之間沒有相關性。
沒有詳細的CEZ生境描述，這將允許驗證特定環境變量對田鼠 SK微生物群組成的潛在作用(?)。儘管如此,歷史記錄表明,紅森林具有更高的可用細菌多樣性，可能因為事故發生後大量的森林碎片, 植被和土壤從這個區域被推平進戰壕, 埋在核事故發生地點，這可能創造了具高微生物多樣性的潛在區域。CEZ區域SK微生物群的alpha多樣性增加另一個可能原因是人類活動的缺乏，從而限制了該地區的土地利用(例如林業、農業)。CEZ區域位於白俄羅斯境內大型哺乳動物密度的提高可能歸因於人類影響的減小。兩個KL重複採樣點都位於連續的、基本未受幹擾的森林中。然而，由於這些地點對人類來說是可以到達的，而且相對接近基輔(歐洲人口第七多的城市)，因此有可能對環境生物多樣性造成人為影響，這可能導致相關的微生物多樣性減少。
SK和GI菌群的比較
Comparison of SK and GI microbiomes
SK和GI菌群在群落多樣性上存在內在的差異，對不同的環境誘因有明顯不同的響應。堤岸田鼠SK比GI具有更高的多樣性，這與人類的情況一致，但不同於其它野生動物。SK和GI微生物群落對宿主健康有重要的影響，但兩者之間存在比較研究，且來自同一個體的GI和SK微生物群的工作是非常罕見的。雖然預測微生物群落的不同與空間分離之間存在正相關關係是合理的，但這對SK來說顯而易見是正確的，但對GI來說，卻並非如此。唯一一項比較野生哺乳動物SK和GI微生物群的研究（袋獾）同樣也發現地理因素只對SK菌群有顯著影響，而SK和GI菌群在寄主被圈養的情況下明顯地聚集在一起。我們對受汙染地區(相距約7-34公裡)和未受汙染地區(相距約9-80公裡)進行重複採樣，可能會增加噪音，但對消除特定地點的其他環境因素對輻射暴露(如果有的話)的潛在影響至關重要。個體水平的劑量測定數據估計了田鼠(1)外部輻射暴露和(2)全身輻射負荷，表明從CH採集的田鼠暴露於較高水平的輻射中，但這種暴露對SK微生物群組成幾乎沒有顯著影響。因此，令人驚訝的是，GI，而不是SK，微生物群對土壤核輻射局部升高有反應。
與GI菌群相似，SK菌群與宿主免疫系統有重要的作用。宿主相關的微生物群可以是共生的、互利的或致病的，也可以根據環境背景(如宿主的炎症和代謝狀態)改變它們與宿主的關係。
雖然取樣樣本田鼠的炎症狀況尚不清楚，但對脾臟轉錄組進行分析(Kesaniemi等人未發表的數據)發現，居住在CEZ汙染區域內的田鼠存在適應性免疫系統抑制(抗原處理受損)的跡象。環境壓力可能通過微生物群落的變化對宿主健康產生影響，例如將一些共生物種轉化為機會性病原體和/或炎症觸發。對GI和SK細菌功能的進一步研究，以及對宿主免疫狀態的直接測量，可能有助於闡明這兩個微生物群之間的機制差異(如果有的話)，並揭示對田鼠健康有影響的關鍵因素。
健康個體內的SK和GI微生物群應該是不同的，這反映了它們在各自截然不同的生態位上的選擇:胃腸道(結腸區域)主要由密集的厭氧菌群組成，這些厭氧菌群促進消化，而皮膚則承載著多樣的，但是生物量非常小的微生物群，且能夠容忍相對匱乏的營養條件。 考慮到這一點，SK和GI微生物群之間越來越相似的模式與居住在CEZ汙染區域有關。這可能反映了鼠群SK菌群中糞便細菌的增多。例如，S24-7家族的成員幾乎只在恆溫動物的腸道中發現(並且在堤岸田鼠腸道中佔據46%)也存在於堤岸田鼠的SK菌群中，來自KL的數量約為CL和CH的兩倍。
SK菌群中GI菌群影響增加的一個可能原因可能是與居住在受汙染環境有關的自我修飾行為的改變; 例如，梳理毛髮較少的動物會在受汙染的土壤中攝入較少的放射性顆粒。另外，自我修飾的減少可能表明長期的壓力反應。鑑於SK和GI微生物群落在健康方面都發揮著重要作用，確定個體內微生物群落的這種明顯均質化是否為與核輻射相關的一種生物失調值得深入研究。
暴露在高水平的電離輻射下可能對生物造成選擇性壓力，而居住在CEZ汙染區域內的生物可能需要適當的進化反應。SK微生物群可能已經適應了放射性核素的暴露，儘管這一解釋未能解釋在同一田鼠宿主內經歷類似輻射暴露的SK和GI微生物群所表現出的不同空間尺度的群落結構。細菌似乎不太可能從胃腸道天生對輻射更敏感。雖然從土壤暴露在外部劑量放射性核素可能影響SK和胃腸道微生物,微生物群棲居於胃腸道也可能受到內部高劑量的輻射汙染食物，作為內部暴露於放射性核素貢獻高達30%的總輻射吸收劑量田鼠棲息CEZ。此外，由於SK菌群是通過與環境的接觸來確定的，而GI菌群在很大程度上是由宿主的飲食來塑造的，所以GI和SK菌群的差異可能僅僅是由於空間變異造成的。 例如，在GI菌群的顯著變化可以反映CEZ汙染區內無脊椎動物群落生物多樣性的減少. 事實上，宿主飲食對胃腸道微生物群有直接的影響。因此，田鼠的GI微生物群可能會發生變化，並對環境做出更快的反應。相比之下，CEZ內田鼠SK菌群變異相對較少，反映了田鼠在覓食和/或尋找配偶時，在運動過程中不斷獲取和沉積環境微生物的過程。因此，在放射性核素汙染對SK菌群分類學組成沒有強影響的情況下，SK菌群的分化在更大的空間上發展.
結論
Conclusions
哺乳動物SK菌群的變化主要是由棲息地和寄主性別的環境差異所決定的，而不是由放射性核素汙染水平所決定的。居住在CEZ的堤岸田鼠的特徵是高SK菌群多樣性，可能反映了缺乏人為幹擾。本研究顯示SK和GI微生物群落在不同的空間尺度上是如何變化的，這可能反映了環境和宿主飲食在空間變化上的不匹配。最後，我們證明居住在被放射性核素汙染的地區有可能具有使同一個體的SK和GI微生物產生同化的趨勢。未來的工作將需要研究SK群落結構和多樣性變化的適應性(如果有的話)影響，以及微生物群落均質化的適應度結果。目前還不清楚我們的發現是針對田鼠、齧齒動物的，還是其他物種間更普遍的相似模式。因此，我們建議未來的研究應該集中在多個微生物群落的大量宿主，進而對環境-宿主-微生物相互作用進行更廣泛的推斷。
展望
這一項研究目前僅關注了CEZ區域一個物種SK和GI菌群對核汙染的響應，而未對不同的類群進行對比，也沒有對菌群的功能進行細緻的分析，下一步的研究可以在這兩個方面深入。
參考文獻
Lavrinienko A, Tukalenko E, Mappes T, Watts PC. 2018. Skin and gut microbiomes of a wild mammal respond to different environmental cues. Microbiome 6(1):209. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0595-0
Lavrinienko A, Mappes T, Tukalenko E, Mousseau TA, Møller AP, Knight R, et al. Environmental radiation alters the gut microbiome of the bank vole
Myodes glareolus. The ISME Journal. 2018;12:2801–2806.
本文譯者簡介
葛德燕博士，中國科學院動物研究所副研究員。2009年博士畢業於中國科學院動物研究所，2011年中國科學院動物研究所動物學博士後流動站出站。目前已發表科研論文和專著近50篇。2019年初加入宏基因組編輯團隊。