論文｜纖維素分解菌的篩選與鑑定

作者：張海豔，王文磊，韓錳

單位：洛陽師範學院生命科學學院

簡介：張海豔，講師，碩士，從事生物化學教學與研究。

基金項目：河南省高等學校重點科研項目(19A180023)。

來源：《安徽農業科學》2020年15期

OSID開放科學計劃

長按識別論文專屬二維碼，聽作者講述論文寫作背景，與同行交流心得體會。

世界上最豐富的可再生資源非纖維素莫屬，然而纖維素結晶區和非結晶區彼此交織的獨特結構使得酶分子及化學試劑難以與這種緻密結構的表面結合，造成纖維素利用率低下。尤其是作物秸稈，大部分被焚燒，既浪費資源又汙染環境。纖維素具有代替糧食生產酒精、生產飼料蛋白、有機酸發酵、製取功能性寡糖等潛在功能。對纖維素資源的開發和利用意義重大。

目前，降解纖維素主要採用高酸和高鹼等處理的化學方法以及離子輻射等物理方法，但這些方法條件不易控制，極易造成二次汙染，而採用生物法分解纖維素具有反應溫和、成本較低和無汙染等優點。纖維素分解菌的篩選鑑定是高效利用纖維素資源的前提。

目 的

研究高效纖維素分解菌生長情況和CMC酶活水平，以期為纖維素資源高效利用提供研究依據。

方 法

以河南省洛陽市龍峪灣景區腐殖土為研究材料，通過剛果紅染色法，篩選出高效纖維素分解菌，對其進行形態學及分子學鑑定。

結 果

◆纖維素分解菌的篩選

剛果紅染色後篩選出4株透明圈明顯的菌株，如圖1所示。由表1可見，各菌株的D/d值由大到小依次為菌株Ⅱ、菌株Ⅰ、菌株Ⅲ、菌株Ⅳ。菌株Ⅱ的D/d值最高（3.00）。

圖1 4株纖維素分解菌透明圈

◆糖化水平和纖維素酶活分析

葡萄糖標準曲線

由圖2可見，葡萄糖標準曲線方程和相關性係數分別為：y=0.8071x-0.01，R²=0.9982。散點圖相關性係數R²=0.9978。該圖線性關係良好，可以為纖維素酶活的測定提供準確的計算數據和參考。

圖2 葡萄糖標準曲線

糖化水平測定

圖3表明，菌株Ⅱ的糖化水平最高，葡萄糖濃度為0.046mg/mL；菌株Ⅳ糖化水平最低，葡萄糖濃度為0.029mg/mL；菌株Ⅰ和菌株Ⅲ的葡萄糖濃度分別為0.041和0.037mg/mL。4株菌糖化水平的測定結果基本與D/d值一致。

圖3 4株纖維素分解菌糖化水平

纖維素酶活測定

圖4表明，菌株Ⅱ纖維素酶活力最高，為0.0059U/mL；菌株Ⅰ的纖維素酶活力次之，為0.0053 U/mL；菌株Ⅳ的纖維素酶活力最低，僅為0.0038U/mL；菌株Ⅲ的纖維素酶活力為0.0048 U/mL。

圖4 4株纖維素分解菌的獨特結構酶活力

形態學鑑定

選擇糖化水平和纖維素酶活力較高的菌株Ⅰ、Ⅱ進行鑑定。菌落形態如圖5所示，菌株Ⅰ菌落邊緣整齊、乾燥、無褶皺；菌株Ⅱ邊緣整齊、黏稠、無褶皺；革蘭氏染色均為陽性菌。

圖5 2株纖維素分解菌落形態

◆16S rRNA基因分子鑑定

提取菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的DNA。經PCR擴增之後，結果顯示，電泳條帶整齊、單一，長度在1500 bp左右（圖6）。測序結果在NCBI網站上通過BLAST程序進行比對分析，結果顯示二者與芽孢桿菌屬的16S rRNA基因序列同源性分別為98%和99%。

圖6 PCR擴增產物電泳結果

菌株Ⅰ和菌株Ⅱ的16S rRNA系統發育樹，如圖7和圖8所示。菌株Ⅰ與Bacillus pumilusstrain 35（登錄號：KX218316.1）的親緣關係最近，為99%，結合鑑定結果，將菌株Ⅰ命名為Bacillus pumilusWL-1。菌株Ⅱ與Bacillus pumilusstrain BAB 1322（登錄號：KF725774.1）的親緣關係為99%，結合鑑定結果，將菌株Ⅱ命名為Bacillus pumilus WL-2。

圖7 菌株Ⅰ的16S rRNA基因序列的系統發育樹

圖8 菌株Ⅱ的16S rRNA基因序列的系統發育樹

結 論

鑑定該研究篩選的2株纖維素分解菌都為短小芽孢桿菌。菌株Ⅰ的纖維素酶活力0.0053 U/mL，與Bacillus pumilusstrain 35的親緣關係為99%，命名為Bacillus pumilusWL-1，為革蘭氏陽性菌；菌株Ⅱ的纖維素酶活力0.0059U/mL，與Bacillus pumilusstrain BAB-1322的親緣關係為99%，命名為Bacillus pumilusWL-2，為革蘭氏陽性菌。篩選的纖維素分解菌具有較強的纖維降解能力，可有效提高纖維素資源的開發利用。

♔採編：小白 ♔排版：小同