細菌鑑定中常用的生理生化反應——萬融實驗

【實驗目的】

（1）了解細菌對大分子物質水解的原理和方法。

（2）了解糖發酵、IMViC和H2S試驗的原理和方法。

（3）通過不同微生物對不同物質的利用和代謝能力，認識微生物生理類型的多樣性。

【實驗原理】微生物代謝類型的多樣性使得微生物在自然界的物質循環中起著重要作用，同時為人類開發利用微生物資源提供更多的機會與途徑。微生物代謝類型多樣性具體表現在生理生化反應的多樣性。不同細菌具有不同的酶系統，分解糖類、胺基酸等有機物的能力各異，從而使產生的分解產物亦有不同。因此，藉助各種生理生化反應可以鑑別細菌的種類，這是微生物分類鑑定的重要依據。

1．大分子物質水解微生物在生長繁殖過程中需要不斷地從外界環境中吸收營養物質。環境中的大分子有機物必須經微生物分泌的胞外酶將其分解為小分子有機物才能被細胞吸收利用。不同的微生物分解利用生物大分子的能力不同，只有那些能夠產生並分泌胞外酶的微生物才能利用相應的大分子有機物。微生物是否具有利用某種大分子物質的能力，可通過觀察細菌菌落周圍的底物變化來判斷，如澱粉遇碘液會產生藍色，但在細菌水解澱粉的區域，用碘測定不再產生藍色，表明細菌能水解澱粉。

2．糖發酵試驗糖發酵試驗常用於鑑定細菌對葡萄糖和乳糖等單糖的利用能力。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖類物質的能力上有很大的差異。有些細菌產酸產氣，有些細菌只產酸不產氣。產酸情況一般用溴甲酚紫指示劑判別，產氣情況則通過觀察液體培養基中倒置的德漢氏小管是否有氣泡來判斷。

3．IMViC和H2S試驗IMViC試驗是吲哚試驗（indol test）、甲基紅試驗（methyl red test）、伏-普試驗（Voges-Prokauer test）和檸檬酸鹽試驗（citrate test）的縮寫，主要用於水的細菌學檢查。吲哚試驗用來檢測細菌對色氨酸的利用能力。有些細菌能產生色氨酸酶，分解蛋白腖中的色氨酸，產生吲哚和丙酮酸，吲哚本身無色，不能直接觀察到，當加入對二甲基氨基苯甲醛試劑時，可形成紅色的玫瑰吲哚，即吲哚試驗陽性。甲基紅試驗用來檢測細菌發酵葡萄糖的產酸能力。當細菌代謝糖大量產酸時，就會使加入培養基中的甲基紅指示劑由橘黃色（pH6.3）變為紅色（pH4.2），即甲基紅反應陽性。伏-普試驗用來測定某些細菌利用葡萄糖產生非酸性或中性末端產物的能力。如產氣腸桿菌發酵葡萄糖產生的丙酮酸大量進行縮合、脫羧，生成乙醯甲基甲醇，此化合物在鹼性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙醯，二乙醯與蛋白腖中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物，即伏-普反應陽性。檸檬酸鹽試驗用來檢測細菌利用檸檬酸的能力。有些細菌能分解檸檬酸形成CO2，同時由於培養基中鈉離子的存在而形成碳酸鈉，使pH升高。若用溴麝香草酚藍作為指示劑，培養基顏色由綠色（pH6.0～7.6）變為藍色（pH>7.6）時，即反應陽性。硫化氫試驗用來檢測某些細菌能否分解含硫胺基酸，生成硫化氫。硫化氫遇培養基內的鐵鹽或鉛鹽，則形成黑褐色的硫化鐵或硫化鉛沉澱物。黑褐色沉澱物愈多，表示生成的硫化氫量愈多。

【實驗器材】

1．菌種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）。

2．培養基澱粉培養基、明膠培養基、糖發酵培養基、蛋白腖水培養基、葡萄糖蛋白腖水培養基、檸檬酸鈉斜面培養基、檸檬酸鐵銨培養基。3．試劑盧戈氏碘液、甲基紅試劑、40％KOH溶液、5％α-萘酚、乙醚、吲哚試劑。4．儀器和用具培養箱、超淨臺、接種環、接種針、無菌培養皿、試管、試管架、記號筆等。

【實驗步驟】

1．大分子物質水解

（1）澱粉水解

1）制平板：將澱粉培養基溶化後冷卻至50℃左右，倒入無菌平皿，冷凝製成平板。在平皿底部用記號筆將平板劃為二等份（視需要定，一般至多五等份）。2）接種：將枯草芽孢桿菌和大腸桿菌分別劃線接種在指定區域，做上記號。3）培養：將培養皿倒置於37℃恆溫箱中培養24～48h。4）觀察：打開皿蓋，滴加少量碘液於平板上，輕輕旋轉，使碘液均勻鋪滿整個平板。如果菌落周圍出現無色透明區，則說明澱粉已被水解。

（2）明膠水解明膠是一種動物蛋白，用其配製的培養基在低於20℃的溫度下凝固，高於24℃的溫度下自行液化。明膠在細菌產生的蛋白酶（胞外酶）作用下，可水解成為小分子物質，此時雖在低於20℃的條件下，亦不再凝固，而由原來的凝固狀態變為液體狀態。

1）接種：用穿刺法將枯草芽孢桿菌和大腸桿菌分別接種在2支明膠培養基試管中。2）培養：20℃下培養48h。3）觀察：觀察培養基是否液化（圖6-1）。如果細菌在此溫度下不能生長，則必須在所需的最適溫度下培養。觀察結果時需將試管從恆溫箱中取出，置於冰浴或冰箱中，30min後取出立即傾斜試管，如試管中培養基部分或全部呈液化狀態，表明試驗菌為陽性；否則為陰性。

圖6-1　明膠穿刺液化的觀察

2．糖發酵試驗

（1）葡萄糖發酵試驗

1）接種：分別將大腸桿菌和普通變形桿菌接種於葡萄糖發酵培養基試管中，另取一支相同培養基試管不接種作為空白對照。注意：接種前檢查培養基，其中倒立小管應無氣泡。2）培養：37℃培養，分別在24h、36h、72h時觀察結果。3）觀察：若糖發酵培養基中所含的葡萄糖而產酸，則指示劑使培養基由紫色（pH6.8）轉變為黃色（pH5.2）；如果發酵葡萄糖時產酸兼產氣，則培養基除變色外，倒置的德漢氏小管內有氣泡產生。注意：應先確定細菌是否生長，若生長，則培養基變混濁。生長緩慢者需延長培養觀察時間。

（2）乳糖發酵試驗方法同上，所用培養基為乳糖發酵培養基。

3．IMViC試驗和H2S試驗

（1）吲哚試驗

1）接種：分別將大腸桿菌和產氣腸桿菌接種於蛋白腖水培養基試管中，另取一支不接種作為對照。2）培養：37℃培養24h。3）觀察：在培養液中加入乙醚約1mL，充分振蕩，使吲哚溶於乙醚中。靜置片刻，待乙醚層浮於液面後形成明顯的乙醚層，再沿管壁加入吲哚試劑8～10滴。如有吲哚存在，則乙醚層呈現玫瑰紅色，為陽性反應；不呈現紅色則為陰性反應。注意：加入吲哚試劑後試管不可再搖動，否則結果不明顯。

（2）甲基紅試驗和伏-普試驗1）接種：分別將大腸桿菌和產氣腸桿菌接種於葡萄糖蛋白腖水培養基試管中，連同空白對照置37℃培養24h。2）觀察：取潔淨空試管，將每支試管中培養液一分為二，分別用於甲基紅試驗和伏-普試驗。3）甲基紅試驗：沿試管壁向培養液中加入甲基紅試劑4～6滴，呈鮮紅色者為甲基紅試驗陽性，呈橘黃色者為陰性。4）伏-普試驗：在培養液中加入40％KOH溶液10滴，再加入等量的5％萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃恆溫箱中保溫15～30min或在沸水中加熱1～2min，如培養液呈紅色為反應陽性。

（3）檸檬酸鹽試驗1）接種：分別將大腸桿菌和產氣腸桿菌接種於檸檬酸鈉培養基斜面上，另取一支不接種作為空白對照。2）培養：37℃培養24～48h。3）觀察：觀察培養基顏色變化，含有溴麝香草酚藍的斜面呈藍色者為陽性反應，呈綠色者為陰性反應。

（4）H2S試驗

1）接種：穿刺接種大腸桿菌和產氣腸桿菌於檸檬酸鐵銨培養基中。2）培養：37℃培養24h。3）觀察：沿穿刺線部位呈黑褐色者為陽性，顏色不變則為陰性。

【實驗報告】1．實驗結果將結果填入表6-1～6-3，以「＋」表示陽性反應，以「—」表示陰性反應。

表6-1　糖發酵試驗結果

表6-2　大分子物質水解試驗結果

表6-3　IMViC和H2S試驗結果

3．思考題

（1）自然界的纖維素資源非常豐富，但能分解利用纖維素的只有微生物中的少數幾種。由於纖維素不溶於水，篩選纖維素分解菌時應如何設計實驗？

（2）試述糖發酵和IMViC試驗在水、食品等細菌學檢查中的意義。（申秀英）