按照BSL-4標準建造的實驗室，也稱為高度實驗室生物安全。實驗室為獨立的建築物，或在建築物內一切其它區域相隔離的可控制的區域。為防止微生物傳播和汙染環境，BSL-4實驗室必須實施特殊的設計和工藝。在此沒有提到的BSL-3要求的各條款在BSL-4中都應做到。其具體的標準微生物操作、特殊操作、安全設備和實驗室設施要求如下：
4.1標準操作
(1)限制進入實驗室的人員數量。
(2)制定安全操作利器的規程。
(3)減少或避免氣溶膠發生。
(4)工作檯面每天至少消毒一次，任何濺出物都要及時消毒。
(5)一切廢棄物在處理前要高壓滅菌。
(6)昆蟲和嚙齒類動物控制按有關規定執行。
(7)嚴格控制菌、毒種(見前)。
4.2特殊操作
(1)人員進入
只有工作需要的人員和設備運轉需要的人員經過系統的生物安全培訓，並經過批准後方能進入實驗室。負責人或監督人有責任慎重處理每一個情況，確定進入實驗室工作的人員。採用門禁系統限制人員進入。進入人員由實驗室負責人、安全控制員管理。人員進入前要告知他們潛在的生物危險，教會他們使用安全裝置。工作人員要遵守實驗室進出程序。制定應對緊急事件切實可行的對策和預案。
(2)危害警告
當實驗室內有傳染性材料或感染動物時，在所有的入口門上展示危險標誌和普遍防禦信號，說明微生物的種類、實驗室負責人和其他責任人的名單和進入此區域特殊的要求。
(3)負責人職責
實驗室負責人有責任保證，在BSL-4內工作之前，所有工作人員已經高度熟練掌握標準微生物操作技術、特殊操作和設施運轉的特殊技能。這包括實驗室負責人和具有豐富的安全微生物操作和工作經驗專家培訓時所提供的內容和安全委員會的要求。
(4)免疫接種
工作人員要接受試驗病原體或實驗室內潛在病原微生物的免疫注射。
(a)血清學監督：對實驗室所有工作人員和其他有感染危險的人員採集本底血清並保存，再根據操作情況和實驗室功能不定期血樣採集。進行血清學監督。對致病微生物抗體評價方法要注意適用性。項目進行中，要保證每個階段血清樣本的檢測，並把結果通知本人。
(b)安全手冊：制定生物安全手冊。告知工作人員特殊的生物危險，要求他們認真閱讀並在實際工作當中嚴格執行。
(c)技術培訓：工作人員必須經過操作最危險病原微生物的全面培訓，建立普遍防禦意識，學會對暴露危害的評價方法，學習物理防護設備和設施的設計原理和特點。每年訓練一次，規程一旦修改要增加訓練次數。由對這些病原微生物工作受過嚴格訓練和具有豐富工作經驗的專家或安全委員會指導、監督進行工作。
(d)緊急通道只有在緊急情況下才能經過氣閘門進出實驗室。實驗室內要有緊急通道的明顯標識。
(e)在安全櫃型實驗室中，工作人員的衣服在外更衣室脫下保存。穿上全套的實驗服裝(包括外衣、褲子、內衣或者連衣褲、鞋、手套)後進入。在離開實驗室進入淋浴間之前，在內更衣室脫下實驗服裝。服裝洗前應高壓滅菌。在防護服型實驗室中，工作人員必須穿正壓防護服方可進入。離開時，必須進入消毒淋浴間消毒。
(f)實驗材料和用品要通過雙扉高壓滅菌器、燻蒸消毒室或傳遞窗送入，每次使用前後對這些傳遞室進行適當消毒。
(g)對利器，包括針頭、注射器、玻璃片、吸管、毛吸管和解剖刀，必須採取高度有效的防範措施。儘量不使用針頭、注射器和其它銳利的器具。只有在必要時，如實質器官的注射、靜脈切開或從動物體內和瓶子裡吸取液體時才能使用，儘量用塑料製品代替玻璃製品。在注射和抽取傳染性材料時，只能使用鎖定針頭的或一次性的注射器(針頭與注射器一體的)。使用過的針頭在處理之前，不能折彎、折斷、破損，要精心操作，不要蓋上原來的針頭帽;放在固定方便且不會刺破的用於處理利器的容器裡。不能處理的利器，必須放在器壁堅硬的容器內，運輸到消毒區，高壓消毒滅菌。可以使用套管針管和套管針頭、無針頭注射器和其它安全器具。破損的玻璃不能用手直接操作，必須用機械的方法清除，如刷子、簸萁、夾子和鑷子。盛汙染針頭、銳利器具、碎玻璃等，在處理前一律消毒，消毒後處理按照國家或地方的有關規定實施。
(h)從BSL-4拿出活的或原封不動的材料時，先將其放在堅固密封的一級容器內，再密封在不能破損的二級容器裡，經過消毒劑浸泡或消毒燻蒸後通過專用氣閘取出。
(i)除活體或原封不動的生物材料以外的物品，除非經過消毒滅菌，否則不能從BSL-4拿出。不耐高熱和蒸汽的器具物品可在專用消毒通道或小室內用燻蒸消毒。
(j)完成傳染性材料工作之後，特別是有傳染性材料溢出、濺出或汙染時，都要嚴格徹底地滅菌。實驗室內儀器要進行常規消毒。
(k)傳染性材料濺出的消毒清潔工作，由適宜的專業人員進行。並將事故的經過在實驗室內公示。
(l)建立報告實驗室暴露事故、僱員缺勤制度和系統，以便對與實驗室潛在危險相關的疾病進行醫學監督。對該系統要建造一個病房或觀察室，以便需要時，檢疫、隔離、治療與實驗室相關的病人。
(m)與實驗無關的物品(植物、動物和衣物)不許進入實驗室。
4.3安全設備(初級防護屏障)
在設施汙染和半汙染工作區域內的一切操作都應在Ⅲ級生物安全櫃內進行。如工作人員穿著具有生命支持通風系統的正壓防護服，可在Ⅱ級生物安全櫃內進行實驗操作。
4.4實驗室設施(次級防護屏障)
BSL-4實驗室有兩種類型：安全櫃型，即所有病原微生物的操作均在Ⅲ級生物安全櫃內或隔離器進行;防護服型，即工作人員穿正壓防護服工作，操作可在Ⅱ級生物安全櫃內進行。也可以在同一設施內穿正壓防護服，並使用Ⅲ級生物安全櫃。
(1)安全櫃型
BSL-4建築物或獨立，或在系統建築中由一個清潔區或隔牆把它與其它區域隔離開。中心實驗室(汙染區)裝有Ⅲ級生物安全櫃，實驗室周圍為足夠寬的隔離帶，如環形走廊(半汙染區)。從隔離帶進出實驗室必須通過一個緩衝間。在汙染區和半汙染區之間，安裝兩臺以上生物安全型高壓蒸汽滅菌器(一次滅菌)，互為備用。外更衣室(清潔區)與內更衣室(半汙染區)由淋浴間(清潔區)隔開，人員進出經過淋浴間。在清潔區與半汙染區之間設置一個通風的雙門傳遞通道，為不可通過更衣室進入實驗室的實驗材料、實驗用品或儀器通過物理屏障時提供通道和消毒。在清潔區與半汙染區之間同樣安置一臺生物安全型高壓滅菌器，用於二次消毒。每天工作開始之前，檢查所有物理防護參數(如壓差)。
實驗區的牆、地和天棚整體密封，便於燻蒸消毒。內表面耐水和化學製劑、便於消毒。實驗區任何液體必須排放到有消毒裝置的儲液罐，經過有效滅菌達標排放。通風口和在線管道都要安裝HEPA過濾器。工作檯面不滲水，耐中等熱、有機溶劑、酸、鹼和常用消毒劑的腐蝕。
實驗室用具事先設計，便於安放穩妥和使用，彼此留有一定空間便於清潔衛生，桌椅表面易於消毒。內外更衣室和實驗室進出門附近安裝非手動或自動開關的洗手池。排風經過2個串連的HEPA過濾，送、排風過濾器安裝應便於消毒和更換。供水、供氣均安裝防止回流的裝置加以保護。如果提供水源(消防噴槍)，其開關應該是安裝在實驗室外面走廊裡，開關自動或非手動。此系統與實驗室區域供水分配系統分開，配備防止回流裝置。實驗室進出門自動鎖閉。實驗室內所有窗戶都必須是封閉窗。從Ⅲ級安全櫃和實驗室傳出的材料必須經雙扉高壓滅菌器滅菌。滅菌器與周圍物理屏障的牆之間要密封。滅菌器的門自動連鎖控制，以保證只有在滅菌過程全部完成後才能開啟外門。從Ⅲ級安全櫃或實驗室內要拿出的材料和儀器，不能用高壓滅菌消毒的要通過液體浸泡消毒、氣體燻蒸消毒或同等效果的消毒裝置進行消毒和傳遞。來自內更衣室(包括廁所)和實驗室內的洗手、地漏、高壓滅菌器的廢水以及其它廢水，在排入公共下水之前，都要使用可靠的方法消毒(熱處理比較合適)。淋浴和清潔區一側廁所的廢水不需特殊處理就可排入公共下水。所用廢水消毒方法必須具有物理學和生物學的監測措施和法規確認。
非循環的負壓通風系統，供、排風系統應採用壓力無關裝置保持動態平衡，保證氣流從最低危險區向最高危險區的方向流動。對相鄰區域的壓差或氣流方向進行監測，能進行系統聲光報警。應安裝一套能指示和確認實驗室壓差、適用而可視的氣壓監測裝置，其顯示部分安裝在外更衣室的進口處。Ⅲ級生物安全櫃與排風系統相連。
實驗室的供排氣都要經過HEPA過濾。為了縮短工作管道潛在的汙染，HEPA儘可能安裝在靠近工作的地方。所有HEPA每年均須檢測一次，同時在靠近HEPA的地方應安裝零洩露氣密閥，便於過濾器安裝與消毒更換。HEPA上遊安裝預過濾器可延長其使用壽命。
安全櫃型生物安全水平Ⅳ級實驗室的設計和操作程序是指令性的。實驗室必須經過檢測、鑑定和驗收。只有合乎設計要求和運行標準的才能啟用。實驗室的驗收或年檢應參考ISO10648標準檢測方法進行密封性測試，其檢測壓力不低於500Pa，半小時的小時洩漏率不超過10%，以保證維護結構的可靠性。實驗室每年必須檢測一次，確認合乎設計和運行參數的要求，才能繼續運行。實驗室內外應有適合的通訊聯繫設施(電話、傳真、計算機等)，進行無紙化操作。
(2)防護服型
BSL-4建築物獨立，或在系統建築中由一個清潔區或隔牆把它與建築物其它區域隔開。實驗室房間的安排與安全櫃型基本相同。不同的是在進入實驗室(可用Ⅱ級生物安全櫃代替Ⅲ級生物安全櫃)之前要穿上有生命支持系統的正壓防護服。生命支持系統所供氣體應滿足可呼吸空氣生產標準，同時應增加緊急排風設施及配有備用電源。進入BSL-4實驗室之前要設置一個更衣和消毒區(設在實驗室的一角或環形走廊內側)。工作人員離開此區之前應在專用消毒室對防護服表面進行藥物噴淋和燻蒸，時間不短於5分鐘。備用電源，在停電時應能夠保證排風、生命支持系統、警鈴、燈光、進出控制和生物安全櫃的應急工作。所有通向實驗區、消毒淋浴室、氣閘的空隙都要封閉。每天實驗開始之前，要完成對所有物理防護參數(如壓差等)和正壓防護服的檢測，以保證實驗室安全運行。在實驗區跨牆安裝雙扉高壓滅菌器，對從實驗區拿出的廢棄物進行一次消毒。高壓滅菌器與物理防護的壁板間要密閉。
設置渡槽、燻蒸消毒傳遞小室(櫃)，供不能通過更衣室進入實驗區的實驗材料、用品或儀器的消毒和傳遞使用。這些設施還能用於不能高壓的材料、用品和儀器安全地取出。在清潔區與半汙染區之間同樣安置一臺雙扉生物安全型高壓滅菌器，用於二次消毒。實驗區的牆、地和天棚整體密封，便於燻蒸消毒。內表面耐水和化學製劑、便於消毒。實驗區任何液體必須排放到有消毒裝置的儲液罐，經過有效滅菌達標排放。通風口和在線管道都要安裝HEPA過濾器。實驗區內部附屬設施，如燈的固定、空氣管道、功能管道等的安排儘可能減少水平表面面積。工作檯面不滲水，中等耐熱、抗有機溶劑、酸、鹼和常用消毒劑的腐蝕。
實驗用具要簡單、分體、適用、牢固，不選用多孔材料。桌、櫃、儀器之間保持一定空間，便於清潔和消毒。實驗用椅和其它用具的表面應易於消毒。實驗區、內外更衣室的洗手池設非手動開關。中央真空系統設在實驗區內，在線HEPA過濾器靠近每一個使用點或開關。過濾器安裝便於消毒和更換。其它進入實驗區的供水、供氣由防止回流裝置加以控制。
實驗區的門採用門禁系統。消毒淋浴、氣閘室的內外門連鎖。來自汙染區內的洗手池、地漏、滅菌器和其它來源的廢水必須排放到有消毒裝置的儲液罐，經過有效滅菌達標排放。來自淋浴和廁所的廢水經處理後排入下水道。所用的廢水消毒方法的效果要有物理學和生物學的證據。
全新風通風系統。供、排風系統應採用壓力無關裝置保持動態平衡，保證氣流從最低危險區向最高危險區的流動。對相鄰區域的壓差或氣流方向進行監測，能進行系統聲光報警。應安裝一套能指示和確認實驗室壓差、適用而可視的氣壓監測裝置，其顯示部分安裝在外更衣室的進口處。
實驗區的供氣要通過一個HEPA過濾處理，排氣要通過串連的2個HEPA過濾處理。空氣向高空排放，遠離進氣口。為了縮短工作管道潛在的汙染，HEPA儘可能安裝在靠近工作的地方。所有HEPA每年均須檢測一次，同時在靠近HEPA的地方應安裝零洩露氣密閥，便於過濾器安裝與消毒更換。HEPA上遊安裝預過濾器可延長其使用壽命。
防護服型生物安全Ⅳ級實驗室設計和運轉要求是指令性的。實驗室必須經過檢測、鑑定和驗收。只有合乎設計要求和運行標準的才能啟用。實驗室的驗收或年檢應參考ISO10648標準檢測方法進行密封性測試，其檢測壓力不低於500Pa，半小時內的小時洩漏率不超過10%，以保證維護結構的可靠性。實驗室每年必須檢測一次，確認合乎設計和運行參數的要求，才能繼續運行。實驗室內外應有適合的通訊聯繫設施(電話、傳真、計算機等)，進行無紙化操作。