測了那麼多數據，你知道測序的原理嗎？
註：測序過程
Illumina分成了四步：
1. sample prep,樣本準備
2. cluster generation，簇的生成
3. sequencing，測序
4. data analysis，數據分析
1. sample prep
樣品準備的方法很多，而所有的方法都是在DNA的末端添加adaptors。通過循環擴增的減少，另外的motif被引入，例如測序結合位點，index以及與flowcell互補結合的區域。
註：左右兩端顏色不同的序列就是新加入的adaptor，index等
2. Cluster generation
成簇是每個分子被等溫擴增的過程。Flowcell是帶有lane流通槽的玻璃板，而每個lane上固定了兩種寡核苷酸。
註：這就是flowcell
雜交發生在兩種寡核苷酸中的一種。
註：紫色為分子片段和lane上的寡核苷酸結合
這個寡核苷酸與一個分子片段的adapter區域結合，聚合酶生成雜交片段的互補片段。雙鏈分子變性，原始模板被洗去，剩下的鏈通過橋式擴增進行克隆擴增。在這個過程中，鏈發生了摺疊，並且adapter與flowcell中的另一種寡核苷酸雜交。聚合酶產生互補鏈，形成雙鏈橋。
註：雙鏈橋的形成過程
該橋被變性，形成2個固定在flowcell上的單鏈分子。
註：解鏈為單鏈
這個過程被反覆的重複，形成數百萬個cluster，從而使所有片段被克隆擴增。橋式擴增後，反向鏈被切斷洗去，留下正向鏈。3『端被鎖住以防止非特異性結合。
3. Sequencing
測序從第一個測序引物的延伸生成第一個read開始。在每個循環過程中，帶有螢光標記的的核苷酸競爭性的加入生長鏈。基於模板序列，只有一個核苷酸被加入。在每添加一個核苷酸後，簇被光源激發，並發射出特異螢光信號，這個過程被稱為邊合成邊測序。循環的次數取決於read的長度。發射波長和信號強度一起，決定了鹼基的call。對於給定的cluster，所有相同的read被同時讀出。在大規模並行的過程中，數以千萬計的簇被測序。在第一個read結束後，read產物被洗去。
註：測序的過程
在這個步驟中，index1的引物被引入並與模板雜交，類似於第一個read，這個read被產生。在index read完成後，read的產物被洗掉，模板3』端被去保護後發生摺疊，並結合在flowcell上的第二個寡核苷酸。Index2和index1一樣被讀取，聚合酶延伸第二個flowcell上的寡核苷酸，形成一個雙鏈橋。然後雙鏈DNA分子被線性化，並將3『端鎖住。原始正向鏈被切除並洗去。只留下反向鏈。Read 2從read2測序引物開始被讀取，和read1一樣，測序步驟被重複，直到達到預期的讀段長度，然後將read2產物洗去。
4. Data Analysis
註：測出的序列
測序的過程產生數百萬的reads，代表著所有分子片段，基於在樣品準備過程中引入獨特的index，來自樣品庫的序列被分離。
註：被分開的序列
對於每個樣品，具有相似延伸的鹼基被成簇。正向和反向reads被配對生成連續序列，這些序列和參考基因組比對，用於突變的確定。
註：map的過程
配對信息被用於解決有歧義的比對。基因組數據可以在BaseSpace Sequence Hub被安全的轉化，儲存和分析和分享。
這就是illumina測序的過程。
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