當前市面上新冠病毒採集管保存和滅活效果不一，亟需建立國家強制標準才能保證滅活徹底和核酸穩定，切實降低假陰性！ 當前，新型冠狀病毒防控形勢仍然十分嚴峻，作為核酸檢測的第一步，樣本採集與保存的重要性毋庸置疑，檢驗業內常說「garbage in, garbage out（垃圾標本出垃圾結果）」，最重要的影響因素首先是樣品採集。如果樣本採集出了問題，那麼後面的各項工作做得再好，其結果也是無效的。目前國內有數百家病毒採集管廠商，很多都宣稱「非胍鹽」「滅活」保存液，它們的實際效果如何？真正能達到滅活病毒嗎？能真正保存病毒RNA不降解嗎？
禽類冠狀病毒雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirinae)成員。該病毒具有多形性，呈現圓形，大小約為80-120 nm。病毒有囊膜，表面有杆狀纖突，形似冠狀。因為禽類冠狀病毒與新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)同屬於冠狀病毒，只能感染雞不能感染人，是一種極好的研究新冠病毒保存液各項參數的替代研究對象。本研究在嚴格實驗室管理規範操作下，用禽類冠狀病毒來探究不同新冠病毒保存液對雞傳染性支氣管炎病毒滅活效果的影響，使用不同病毒保存液處理傳支病毒，並對保存後的傳支病毒樣品進行滅活檢驗。
一 不同病毒保存液對禽類冠狀病毒滅活效果的研究
A、實驗材料：SPF雞胚購自濟南斯帕法斯，並自行孵化至10日齡。雞傳染性支氣管炎病毒採用 IBV QXL87株種毒。實驗所用稀釋液：生理鹽水（0.9% NaCl）高壓滅菌，並保存於4℃冰箱。
B、實驗對象：1號保存液（康為世紀滅活保存液）、2號保存液（國家指導的非滅活型病毒保存液）、3號保存液（A公司滅活保存液）、4號保存液（康為世紀非滅活型病毒保存液）。
C、實驗內容：分為兩部分
1.1．不同病毒保存液滅活效果的雞胚感染比較
將製備好的雞傳染性支氣管炎病毒 QXL87株種毒添加至保存液中，按1（病毒原液）:10（保存液） 比例，置室溫18-26℃滅活45min；將滅活好的病毒液接種SPF雞胚進行滅活檢驗，同時對收穫尿囊液進行雞傳染性支氣管炎病毒核酸檢測，參照GB/T 23197-2008 雞傳染性支氣管炎診斷技術，使用康為世紀RNA提取試劑盒（貨號：CWY070）提取RNA，並使用禽源冠狀病毒核酸檢測試劑盒(PCR螢光探針法)（貨號：CW3120）檢測。具體見下表。
1.2不同病毒保存液滅活效果的驗證研究
根據1.1研究結果，選擇合適的病毒保存液對病毒進行滅活，按獸藥典要求進行滅活檢驗。將滅活好樣品按尿囊腔接種方式接種10日齡SPF雞胚，每個樣品接種10枚雞胚，0.1 mL/枚，置於37℃培養箱中培養144 h，棄去24 h死亡的雞胚，觀察記錄24-144 h雞胚死亡情況和接種後有病變的活胚數的數量。觀察雞胚病變，同時收穫尿囊液進行PCR檢測，即為第一代接種核酸檢測結果。然後將第一次收穫的四個尿囊液進行二次雞胚接種，培養144h後收穫尿囊液進行PCR檢測，即為第二代接種核酸檢測結果。
D、實驗結果和討論
圖註：No1：康為世紀滅活保存液；No2：國家指導的非滅活型病毒保存液；No3：A公司滅活保存液；No4：康為世紀非滅活型病毒保存液
第一代收穫的尿囊液進行IBV核酸檢測。結果發現康為世紀滅活型病毒保存液對病毒消殺非常徹底，幾乎檢測不到。
圖註：No2-1：康為世紀滅活保存液；No2-2：國家指導的非滅活型病毒保存液；No2-3：A公司滅活保存液；No2-4：康為世紀非滅活型病毒保存液
將第一代處理後含病毒樣本進行盲傳，檢測第二代收穫的尿囊液的IBV核酸水平，結果發現只有康為滅活型病毒保存液盲傳一代能完全抑制病毒的繁殖。
二 滅活保存液對RNA保護能力的比較分析
當前市場上的病毒保存液幾乎都是直接保存活病毒，導致採樣、運輸和檢測中的醫護人員均面臨較高的感染風險，針對這種情況，抗疫一線非常需要能直接滅活病毒的樣本保存液，這樣可以大大提高樣本採集、運輸過程中的安全性。但應該注意的是：在滅活病毒的同時，保存液還應考慮能否穩定保存病毒核酸的完整性，避免樣本中的核酸在檢測前降解，造成核酸檢測「假陰性」。
我們對比了市面上含鹽酸胍成分、含異硫氰酸胍成分的保存液和不含胍鹽成分的保存液在37℃條件下保存禽類冠狀病毒的效果。結果發現主要成分是胍鹽的保存液，保存效果非常不理想！
同樣都是37℃的條件，保存1-7天後，使用康為世紀保存液，病毒核酸保存效率基本恆定在100%；而使用其他兩種胍鹽成分保存液，病毒核酸的保存效率逐漸降低，到第7天的時候，已經低於20%，說明RNA隨著時間推移正在劇烈降解！
結論：胍鹽（異硫氰酸胍或鹽酸胍等）作為一種經典的蛋白變性劑，常用於核酸提取中的細胞裂解，也可以達到滅活病毒的效果，但胍鹽成分不具備在常溫條件下保存病毒核酸的能力，極易造成樣本降解，因此不適合用於新冠病毒樣本的保存，所以強烈建議您選擇非胍鹽成分的病毒保存液。
在此，我們呼籲廣大醫療工作者，如果您的採樣目的是進行核酸檢測，而且不需要培養活病毒，那麼在選擇病毒保存液時，需要注意以下幾個方面：
1 採用可以滅活的病毒保存液
當前核酸檢測是對樣本中的病毒RNA進行檢測，需要將病毒裂解，所以只要能保證病毒核酸的完整和穩定就可以了，不需要保存活病毒。因此，在當前抗擊新冠病毒疫情的形勢下，在樣本採集的同時對病毒進行滅活，是更為理想的選擇。市場上也有部分廠家推出了滅活型的保存液，但所用的滅活成分是胍鹽，對比實驗結果發現胍鹽成分保存液不具備在常溫條件下保存病毒核酸的能力，極易造成樣本降解，因此不適合用於新冠病毒樣本的保存，因此，我們推薦含有非胍鹽的蛋白變性劑成分的病毒保存液，可以滅活病毒並保證病毒核酸在常溫保存不降解。
2 採樣管中的保存液體積要適宜
選擇體積適宜的保存液非常重要：
①若每個樣本單獨採樣，建議您選用1ml保存液的病毒採樣管，不僅採樣量能滿足下遊核酸提取檢測需求，且相比3ml的保存液，其病毒的濃度提高了3倍！
②若進行較大規模初篩混檢，3-4人的拭子樣本放在同一採樣管中，建議您選用3ml保存液的病毒採樣管，使樣本量能滿足下遊核酸提取需求，同時提高檢測效率，降低檢測成本。
3 採用可以常溫運輸保存樣本的病毒保存液
因為RNA具有不穩定性，傳統病毒採樣管需要在4℃條件下48小時內運送至實驗室，如果運輸溫度如果不達標，可能會造成病毒核酸降解，導致檢測結果「假陰性」！相比之下，若採用可以常溫運輸並穩定保存病毒核酸的病毒保存液，則可以解決樣本運輸的難題，從而提高檢測結果的準確性。
4 採用可保護樣本免受高溫滅活影響的病毒保存液
國家衛健委相關指南要求在提取病毒核酸前需要對樣本進行高溫滅活（56℃以上處理30min），但北京疾病預防控制中心、北京市預防醫學研究中心等機構在Clinical Chemistry刊發的論文研究顯示高溫滅活會導致病毒核酸降解，從而降低病毒核酸的檢出率，是導致新冠病毒核酸檢出假陰性率過高的原因之一。採用康為病毒保存液保存禽類冠狀病毒，稀釋5個梯度進行提取和檢測，比較高溫滅活處理對核酸完整性的影響。結果表明，康為世紀病毒保存液可保護樣本免受高溫滅活影響。
我們進行了大量比對實驗，各項實驗結果都表明：
1）市面上所謂滅活保存液並不能滅活病毒；
2）很多保存液並不能讓病毒RNA穩定存在。
如果將這些標榜能滅活病毒的非滅活保存液流到市場使用，將會給廣大醫務前線工作者帶來極大隱患，讓我們抗疫鬥爭功虧一簣。因此，我們呼籲國家儘快建立新冠病毒採集管技術標準！
編輯：Bling
審校：Rose