構建噬菌體推薦流程

2020-12-10 艾柏森生物

構建噬菌體推薦流程:

1.RNA提取:將用Trizol保存的外周血淋巴細胞轉移至1.5mL的離心管,加入1/5體積的氯仿混勻;室溫靜置5分鐘後4度12000g離心15分鐘;小心將離心後的上清液轉移到新的離心管;往新離心管中加入0.5-1倍體積的異丙醇;室溫靜置10分鐘後4度12000g離心10分鐘;使用與Trizol保存的外周血淋巴細胞等體積的75%乙醇清洗沉澱,4度7500g離心5分鐘後溶解於適量的無RNA酶的水中。

2.反轉錄cDNA:按照反轉錄試劑盒說明書將上一步得到的RNA反轉錄成cDNA。

3.擴增抗體片段:從反轉錄的cNDA中擴增特定的抗體片段使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶進行PCR擴增。

PCR反應體系為:cDNA模板 2ul,ALPVH-C引物2ul,CALL002引物 2ul,10X Taq Buffer 5ul,dNTP 4ul, Taq(HS) 0.25ul,ddH2O補足到50ul。PCR的反應條件為:98度 3分鐘;95度 30秒,57度30秒,68度 40秒,每個循環增加2秒,重複22個循環;68度5分鐘。將得到的PCR擴增產物跑瓊1%脂糖凝膠電泳,可以看到一條1.0kb左右一條0.7kb左右的兩條條帶,對0.7kb大小的條帶切膠使用天根DNA純化回收試劑盒按說明書回收。

從上一步PCR擴增並回收後DNA片段中再次擴增特定的抗體片段使用Taq DNA Polymerase Hot Start Version酶進行PCR擴增。PCR反應體系為:DNA模板 2ul,Rvhh-FP引物 2ul,Rvhh-RP引物 2ul,10X Taq Buffer 5ul, dNTP 4ul, Taq(HS) 0.25ul, ddH2O補足到50ul。PCR的反應條件為:98度 3分鐘;95度 50秒,55度30秒,72度 40秒,重複12個循環;72度10分鐘。將得到的PCR擴增產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收。

4.克隆至噬菌體質粒:將上一步擴增得到的抗體基因序列和噬菌體載體使用BglI酶切,酶切體系為:擴增基因12ug或者載體3ug, 10X BglI Buffer 3ul, BglI 4.5ul, 補足水到30ul。酶切在37度反應3-4小時。酶切後使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收載體和擴增基因後進行連接反應。連接反應體系為:載體 200ng,擴增基因 80ng,T4連接酶 2ul,10X連接緩衝液 5ul,加水直至50ul。在4度過夜反應。將連接產物使用DNA純化回收試劑盒按說明書回收,並使用超純水溶解。

5.轉化SS320:將電轉杯置於冰上預冷,待SS320感受態細胞融化後加入1ul回收後的連接產物,將混合後的感受態細胞和連接產物轉移到預冷好的電轉杯中,使用電轉儀預設的Bacteria轉化程序電擊轉化,電轉後立即往電轉杯中加入1mL SOC培養基,將細胞37度復甦60分鐘後塗在含有四環素和氨苄抗性的LB培養板上過夜生長。

將上一步過夜生長後的培養板上的細胞用LB培養基和塗布棒衝洗刮下,加入20%的甘油後保存在-80度。

6.擴增和純化噬菌體文庫:將上一步刮下的數目約為10^9個細胞轉移到100mL預先加入四環素和氨苄抗生素的2X YT培養液中,37度220rpm培養直至OD600達到0.5。按照輔助噬菌體:細菌細胞數目為20:1的比例加入輔助噬菌體後繼續37度培養30分鐘。加入終濃度為的卡那黴素和0.2mM 的IPTG,30度過夜培養。

將過夜培養的細胞4度13000rpm離心5分鐘,將上清轉移到新的離心管後加入1/4體積預冷的 5X PEG8000/NaCl,在冰上孵育30分鐘。4度13000rpm離心10分鐘去除上清後加入1mL PBS緩衝液溶解沉澱。再次加入250ul 5X PEG8000/NaCl 後冰上孵育10分鐘,4度16000g離心15分鐘後去除上清並將沉澱溶解在1mL PBS中得到噬菌體庫。

相關焦點

  • 基於可變基因在冰塵洞中構建噬菌體泛基因組
    今天分享一篇本月初發表在Nature Communications上的研究——基於可變基因在冰塵洞中構建噬菌體泛基因組。Flexible genes establish widespread bacteriophage pan-genomes in cryoconite hole ecosystems基於可變基因在冰塵洞中構建噬菌體泛基因組
  • Science:炎症促進噬菌體在沙門氏菌之間轉移
    2017年3月19日/生物谷BIOON/---根據一項新的研究,沙門氏菌感染導致的腸道炎症激活這些細菌中的噬菌體(即感染細菌的病毒),從而導致這些噬菌體中的基因在整個菌落中擴散。這一發現揭示出在感染期間,這些病毒編碼的遺傳性狀,如增加的毒力,能夠快速地在這種致病性細菌中出現。
  • 噬菌體病毒為何長得像納米機器人,科學家發現了其中的奧妙
    細菌病毒又叫做噬菌體。今天咱們就來聊聊這個噬菌體病毒。噬菌體從名字上我們就知道這是一種專門感染細菌的病毒。並且科學家研究發現,噬菌體很專一,某種噬菌體只會感染一種細菌。這就很有意思了,我們有句話說「敵人的敵人就是朋友」。噬菌體專門感染細菌,而細菌中有一些是致病菌會讓我們生病,因而有時候噬菌體會幫助我們消滅一些致病菌。所以某些噬菌體病毒對我們人類是有益的。
  • 科學家發現迄今為止最大噬菌體 基因組是普通噬菌體的15倍
    其中有迄今為止發現的最大噬菌體:它的基因組有73.5萬個鹼基對長,幾乎是普通噬菌體的15倍。這個已知最大的噬菌體基因組比許多細菌的基因組大得多。 「我們正在探索地球的微生物群落,有時會出現意想不到的事情。這些病毒細菌是生物的一部分,能複製實體,,但我們對此知之甚少。」
  • 噬菌體治療的前世、今生與未來
    在此背景下, 人類再次把目光投向了噬菌體治療。科學界對噬菌體治療的研究進入了一個新的階段。各個國家的科學家開始尋找各種病原菌的噬菌體, 大量的噬菌體被發現。隨著測序技術的不斷更新換代, 噬菌體更容易被識別, 新的噬菌體基因組序列不斷增加, 新的噬菌體家族不斷壯大。
  • 噬菌體:可對抗超級耐藥菌的病毒「捲土重來」
    現在,噬菌體似乎正回到故事的中心。 最近,The Verge刊發一篇有關噬菌體的長報導《THESE SUPERBUG-FIGHTING VIRUSES ARE MAKING A COMEBACK》。文章討論了數個受益於「噬菌體療法」的臨床案例,梳理了目前噬菌體的應用、前景和挑戰。知幾未來略作翻譯,推薦給您。作者B.
  • 基於擴增子與GeoChip 5.0 聯合分析的噬菌體與原核微生物群落研究
    三、結果1、噬菌體與原核微生物隨著功能的時空變化而動態變化共獲得56143個原核微生物OTUs和來自78種噬菌體的183種噬菌體基因,其中91種噬菌體基因普遍存在於四個厭氧沼氣池中,且其相對豐度是只在平均單個厭氧沼氣池中出現的基因2.4倍,說明優勢噬菌體在不同地點是普遍存在的。
  • 利用噬菌體「釣出」特定肽段 這個奇思妙想曾獲得諾貝爾獎
    德州農工大學的化學家們正在利用噬菌體「釣魚」。這將有助於他們發現新的藥物。噬菌體展示技術是一種將外源肽或蛋白基因與噬菌體特定蛋白基因在其表面進行融合表達的新技術。噬菌體的結構非常簡單,只含有很少的遺傳物質,它們會將自己的遺傳物質注入細菌體內並「劫持」後者的新陳代謝作用,讓細菌成為繼續產生新噬菌體的工廠。科學家們可以將已經擁有的未知基因片段和噬菌體蛋白膜上的一種蛋白質的基因放到一起。當新的噬菌體產生時,對應於那些未知基因的蛋白質將出現在噬菌體的表面,作為其蛋白膜的一部分。
  • 迄今最大噬菌體「現身」
    但美國科學家近日在《自然》雜誌撰文稱,他們最近發現了一些巨型噬菌體,其中最大噬菌體的基因組擁有73.5萬對鹼基,這些複雜的噬菌體模糊了生命和非生命間的界限。 據美國趣味科學網站近日報導,噬菌體是專門感染細菌的病毒。噬菌體和其他病毒不被視為活有機體,但這並不意味著它們無害。
  • 噬菌體效價的測定(雙層瓊脂培養法)——萬融實驗
    一、目的要求學習噬菌體效價測定的基本方法。二、基本原理在宿主細菌生長的固體瓊脂平板上,噬菌體可裂解細菌而形成透明的空斑,稱噬菌體斑,一個噬菌體產生一個噬菌斑,利用這一現象可將分離到的噬菌體進行純化與測定噬菌體的效價。噬菌體的效價就是1ml培養液中所含活噬菌體的數量。效價測定的方法,一般應用雙層瓊脂平板法。
  • Nature Microbiology:噬菌體病毒是否是導致炎症性腸炎的元兇
    最近《自然微生物》雜誌發表了最新的研究成果,部分噬菌體能夠感染胃腸道菌群,這可能與炎症性腸炎(IBD)相關。微生物群落最近一直是炎症性疾病研究的熱點,今年五月份發表的一篇文章表示腸道菌群可能與多發性硬化症有關。而本次的研究發現無疑進一步揭示了在這一過程中感染菌群的噬菌體所發揮的作用。
  • 美科學家稱噬菌體未來可為手機和起搏器充電
    美國加州大學伯克利分校的一支研究小組發現如何從一種叫做「M13」的噬菌體中產生電能,這種細菌具有壓電性,能夠將機械能轉化為電能。
  • 靠裂解酶這張「嘴」 噬菌體輕鬆「吃掉」超級細菌
    歐陽松應表示,而噬菌體及其裂解酶,因具備高效殺菌能力,被譽為糞腸球菌的「天敵」。  「撕碎」細菌細胞壁 噬菌體及其裂解酶成抗菌「生力軍」  噬菌體及其裂解酶為什麼能抗菌?其抗菌機理與現有藥物有什麼不同?
  • Cell子刊發布人體腸道病毒基因組:一份全新噬菌體基線資料庫
    更重要的一點是,病毒宏基因組學方法存在許多明顯的瑕疵,它阻礙了我們對噬菌體群落的進一步認知。比如: 難以區分真正的病毒序列和細菌DNA汙染、DNA擴增偏差;現有病毒資料庫不足,無法分類分配大多數序列(「病毒暗物質」);以及缺乏噬菌體宿主範圍和感染周期類型的信息。
  • The ISME J:CRISPR序列幫助理解噬菌體-宿主相互作用的演變歷史
    圖片來源:medicalxpress.com2015年11月23日 訊 /生物谷BIOON/ --近日,一項刊登在國際雜誌The ISME Journal上的研究報告中,來自美國能源部聯合基因組研究所的研究人員利用來自北加州鐵山公司的宏基因組資料庫和專門的工具,在CRISPRs的幫助下成功地在生態系統研究中將宿主和噬菌體進行了連接
  • Nature:從地球不同環境中發現351種新的巨大噬菌體,它們模糊了病毒...
    在它們當中,存在迄今為止發現的一種最大的噬菌體:它的基因組長735000個鹼基(即735kb),比噬菌體的平均基因組大近15倍。這個已知最大的噬菌體基因組比許多細菌的基因組大得多。Banfield說,「我們正在探索地球的微生物組,有時會出現意想不到的事情。一方面,這些巨大噬菌體彌合了無生命的噬菌體與細菌和古生菌之間的鴻溝。
  • 腸球菌噬菌體竟可增強癌症免疫治療的療效
    在一項新的研究中,來自法國、瑞典、中國、美國、加拿大、義大利、西班牙、丹麥、匈牙利和荷蘭的研究人員發現一類稱為腸球菌的腸道細菌攜帶著可調節免疫反應的噬菌體。噬菌體可整合到腸球菌的基因組中,稱為原噬菌體(prophage)。他們報告了可能與腫瘤細胞相關抗原發生交叉反應的微生物抗原。
  • iOS 的自動構建流程
    目前使用的這套 iOS 構建流程,經歷 2 年的使用,基本穩定下來。這篇文章主要用來記錄📝 目前自己使用的 Jenkins 打包📦腳本。用來打包做類似事情的工具很多,更主要的是為什麼使用自動構建:• 效率上,解放出開發人員的時間。也更方便其他同事使用。• 保證打包的標準,避免配置或環境問題,帶來的失敗。
  • 腫瘤MHC I類限制性抗原與腸球菌噬菌體之間的交叉反應
    腫瘤MHC I類限制性抗原與腸球菌噬菌體之間的交叉反應 作者:小柯機器人 發布時間:2020/8/21 18:40:48 法國古斯塔夫·魯西癌症園區(GRCC)Laurence Zitvogel和Guido Kroemer研究組合作取得最新進展