近日，香港大學研究團隊用一對接近平行且高反射的平面鏡所構成的「無窮鏡」實現可重構的非相干光光片陣列。通過編碼調製單元，對每片光片加載特定的調製頻率，實現對照明光編碼，二維圖像傳感器獲取的螢光圖像序列包含樣品的三維信息，對螢光數據解碼即可實現三維螢光成像。所研製的顯微鏡具有無掃描以及非相干光照明等特點，在器官三維結構、發育生物學、植物生理等需要低損傷的領域具有廣泛的應用前景。相關成果於近日以「Parallelized volumetric fluorescence microscopy with reconfigurable coded incoherent light-sheet array」在線發表在國際頂尖光學期刊《Light: Science & Applications》上。
生物體系複雜系統的動態觀測仍依賴於光學顯微鏡。為適應不同研究體系，光學顯微鏡的兩個不同的研究方向是如何提高解析度以及增大視場範圍。以突破光學衍射極限為目的的超高解析度顯微技術，如受激損耗螢光顯微術、光敏定位顯微術等，獲得2014年諾貝爾化學獎。此外，光片螢光顯微鏡以大視場、多尺度、以及低損傷等優勢，在發育生物學、細胞生物學以及組織三維成像等研究中發揮著獨特的作用。光片螢光顯微鏡的一個重要特色就是採用片狀的照明光照射樣品的特定層，採用側向寬場成像收集螢光信號，和傳統的共聚焦顯微鏡相比，片狀光照明所造成的光損傷更小。為實現三維成像，需要對照明光或者樣品進行機械掃描，這限制了三維成像的速度並對系統的穩定性造成一定影響。目前國際上有些報導採用空間光調製器或者簡單的機械分光（如分束成3束）將雷射束整形成少數片並同時照射到樣品上實現並行激發。通過少數片光照明是通向多片並行化邁出的重要一步，然而，由於所生成的光片數目比較少，三維連續成像仍需要藉助於機械掃描。此外，由於現有技術採用相干光，在散射介質成像中具有一定的制約，如穿透深度增大後散斑效應強烈。如何有效地採用多片照明並對散射介質中的結構進行低損傷、高時空解析度成像仍是光學成像領域的一個研究熱點。
在這項工作中，研究團隊通過無窮鏡將光束整形成相互非相干的一維虛擬光源陣列。通光定製的調製編碼單元，每一個虛擬光源的光強度會以特定的頻率隨時間變化。這個經過時間調製的光源陣列通過光學元件形成單個光片後進入顯微鏡物鏡並照射到螢光樣品上。螢光成像沿用常規光片螢光顯微鏡的側向採集方式。為了並行採集每層的圖像，裝置中人為引入球差增大成像焦深。這種設計提供了一種可行的方案克服了傳統光片螢光顯微鏡由於機械掃描引起的穩定性差以及每層圖像之間有時滯的瓶頸。同時，所採用的雙反射鏡設計有效地在相鄰的兩束光之間引入時間延遲，使得照明的光片之間互不相干，減少在螢光成像中形成雷射散斑，特別適合對散射介質中的結構進行成像。與傳統的基於空間光調製或者雷射分束的技術相比，採用雙反射鏡所生成的多光片具有光片數目以及相干性可控的優勢。由於採用編碼調製結合併行照明，可以實現對樣品的深度結構進行低損傷成像，光損傷比傳統的光片螢光顯微鏡更小。研究團隊利用CLAM對含二氧化鈦的人工散射介質中的螢光高分子微球進行成像，在300 μm穿透深度內仍能得到較好信噪比的圖像。所構建的CLAM系統能對組織透明化的老鼠腎小球以及血管等重要組織結構進行三維成像。CLAM的應用還可以進一步拓展到發育生物學、細胞生長調控等研究，如對斑馬魚、果蠅等模式動物以及植物細胞的實時三維成像。在顯微技術方面，非相干多片光照明以及編碼調製技術可以方便的移植到傳統的商用顯微鏡以及光片螢光顯微鏡上，實現多功能緊湊的光學顯微成像系統。據悉，本論文的核心概念已提交了國際發明專利申請。
圖1. 編碼調製的光片螢光體成像顯微鏡（CLAM）原理示意圖。
（a）所研製的顯微鏡原理示意圖。準直的連續雷射經柱透鏡一維聚焦後進入雙反射鏡腔，一維光錐在腔內多次反射後在不同位置延原有路徑折返。反射光等效於自一系列的虛擬光源發出，經調製單元調製後，每個虛擬光源的光強以特定頻率隨時間變化。虛擬光源可以經光學透鏡轉化成片狀照明光並由物鏡傳遞到樣品上。螢光探測由側向的成像系統完成。
（b）單個虛擬光源光線傳播示意圖。只有離散的光線滿足正入射條件折返，在兩個相鄰的滿足正入射條件光線之間的光線以偏離正入射點的位置折返，這樣能確保在入射光錐內的所有光線都可以被搜集到並用來照明。
（c）調製編碼示意圖。編碼器單元將特定的調製碼加載到每個光片上。
（d）圖像處理示意圖。以傅立葉變換編碼為例，左圖為實際拍攝到的血管分支結構的時序圖像，中間圖為對每個像素序列做傅立葉變換後的頻域圖像，右圖為三維重構後的立體圖。
圖2. 多片光束的產生以及時域調製。
（a）照明光的截面分布（藍色線條顯示的是一維光強分布）。
（b）非相干光照明下能看清散射介質中的結構，而傳統相干光經散射介質會形成散斑。
（c）成像深度和調製頻率呈線性關係。插圖為調製頻譜曲線以及傅立葉調製器的示意圖。
圖3. CLAM顯微鏡性能測試。
（a）依賴位置的點擴散函數分布，右圖為兩個特定的納米顆粒二維截面影像。
（b）三維解析度的盒形圖。（c）利用像差增強成像深度示意圖。（d）引入球差後，納米粒子的成像範圍增大，表明球差會增大成像深度。（e）點擴散函數隨深度的變化表明，在有像差下成像焦深比無像差時增大約32%。（f）在微流通道中運動的微球三維動態影像（體幀速率13.2vol/sec，體積170 μm x25 μm x28 μm）。
圖4.散射介質中螢光微球成像隨穿透深度的變化。
對應的深度為（a,e）30 μm, (b,f) 100 μm, (c,g) 200 μm, (d,h) 300 μm. (c,d) 中右上角為去噪聲後的圖。（e~h）對應（a~d）中虛線框標出的微球的二維（左）以及一維（右）螢光強度分布。 （i）微球圖像信噪比隨穿透深度的變化。
圖5.光學透明的老鼠組織三維成像。
（a）老鼠腎臟表皮血管三維結構以及強度標準差投影（成像體速率為6.6vol/s, 光片數N=34）。老鼠(b)腎小球及(c)腸道血管結構的的三維強度標準差投影圖。（d，e）為對應的(b，c)結構的二維截面影像。（f）在單片以及多片螢光激發光照明下螢光強度的對比表明所研製的成像系統具有更小的光損傷。
（來源：科學網）
相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-020-0245-8