1.基因工程的原理及技術（含PCR技術）（Ⅱ）
(1)概述基因工程的基本操作程序（4步）
電子教材1.目的基因的插入位點不是隨意的
基因表達需要啟動子與終止子的調控,目的基因應插入啟動子與終止子之間的部位。
2.基因表達載體中,啟動子≠起始密碼子,終止子≠終止密碼子
啟動子和終止子位於DNA分子上,其作用和轉錄有關,起始密碼子和終止密碼子位於RNA上,其作用與翻譯有關。
3.受體細胞獲得目的基因並不意味著基因工程的成功
基因工程是否成功表現在目的基因是否成功表達。
方法技巧1.限制酶的選擇方法
(1)應選擇切點位於目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇Pst Ⅰ。不能選擇切點位於目的基因內部的限制酶,如圖甲不能選擇Sma Ⅰ。
(2)切割質粒時,一般所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致,以確保具有相同的黏性末端。質粒作為載體必須具備標記基因、啟動子和終止子等,所以所選擇的限制酶儘量不要破壞這些結構,如圖乙中限制酶Sma Ⅰ會破壞標記基因,且切割位點應位於啟動子和終止子之間以利於目的基因的插入和表達;如果所選限制酶的切點不是一個,則切割重組後可能丟失某些片段,若丟失的片段含複製原點區,則切割重組後的片段進入受體細胞後不能自主複製。
(3)為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接,可使用兩種不同的限制酶切割目的基因和質粒,如圖甲可選擇用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種限制酶的切點)。
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要語強記1.目的基因的獲取方法有：從基因文庫（包括基因組文庫、cDNA文庫）中獲取、利用PCR擴增、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。
2.基因拼接的理論基礎
(1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸;
(2)雙鏈DNA分子的空間結構都是規則的雙螺旋結構。
3.外源基因在受體內表達的理論基礎
(1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位;
(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則闡述的信息流動方向;
(3)生物界共用一套遺傳密碼。
4. 將目的基因導入受體細胞：植物用農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法，動物用顯微注射法，原核生物用Ca2+處理法。植物用體細胞作受體，動物用受精卵作受體。
5.目的基因的檢測與鑑定包括採用DNA分子雜交技術檢測轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因，採用分子雜交技術檢測目的基因是否轉入出了mRNA，通過抗原—抗體雜交技術檢測目的基因是否翻譯成蛋白質及通過個體生物學水平鑑定確認轉基因生物是否被賦予了目的基因控制的生物學特性。
重點精講1、基因工程的步驟
教材旁欄問題和課後習題答案（一）思考與探究
1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什麼？
答：不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達並發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：
（1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利於基因的表達；
（2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；
（3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；
（4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；
（5） 有時需要確定目的基因表達的產物存在於細胞的什麼部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色螢光蛋白基因等。
2.根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理，你能分析出農桿菌不能將目的基因導入單子葉植物的原因嗎？若想將一個抗病基因導入單子葉植物，如小麥，從理論上說，你應該如何做？
提示：農桿菌可分為根瘤農桿菌和髮根農桿菌，在植物基因工程中以根瘤農桿菌的Ti質粒介導的遺傳轉化最多。根瘤農桿菌廣泛存在於雙子葉植物中。據不完全統計，約有93屬643種雙子葉植物對根瘤農桿菌敏感。裸子植物對該菌也敏感。當這些植物被該菌侵染後會誘發腫瘤。近年來，也有報導該菌對單子葉植物也有侵染能力。
根瘤農桿菌侵染植物是一個非常複雜的過程。根瘤農桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產生一些糖類和酚類物質吸引根瘤農桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為乙醯丁香酮和羧基乙醯丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在於單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農桿菌侵染的原因。近年來還發現一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導作用。酚類物質和糖類物質既可以作為根瘤農桿菌的趨化物，又可以作為農桿菌中Ti質粒上Vir區（毒性區）基因的誘導物，使Vir區基因活化，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。
需要注意的是農桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農桿菌侵染單子葉植物進行遺傳轉化時，是需要加上述酚類物質的，同時單子葉植物種類不同，農桿菌侵染進行遺傳轉化的效果也有很大差異。
如果想將一個抗病毒基因轉入小麥，也可以用農桿菌，但要注意兩點：①要選擇合適的農桿菌菌株，因為不是所有的農桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導的物質，一般為乙醯丁香酮等，目的是使農桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農桿菌的Vir區（誘導）的基因，使T-DNA轉移並插入到染色體DNA上。
3.利用大腸桿菌可以生產出人的胰島素，聯繫前面有關細胞器功能的知識，結合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？
提示：有些蛋白質肽鏈上有共價結合的糖鏈，這些糖鏈是在內質網和高爾基複合體上加工完成的，內質網和高爾基複合體存在於真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產這種糖蛋白是不可能的。
4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血症。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產出鼠的β-珠蛋白，想一想，應如何進行設計？
提示：基本操作如下：
（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。
（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環素的基因，構建成一個表達載體。
（3）將表達載體導入無四環素抗性的大腸桿菌中，然後在含有四環素的培養基上培養大腸桿菌。如果表達載體未進入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環素基因而死掉；如果培養基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進入其中。
（4）培養進入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎後從中提取β-珠蛋白。
（二）求異思維
你能推測出由mRNA反轉錄形成cDNA的過程大致分為哪些步驟嗎？
提示：1970年，特明（H.M. Temin）和巴爾的摩（D. Baltimore）證實了RNA病毒中含有一種能將RNA轉錄成DNA的酶，這種酶被稱為依賴RNA的DNA聚合酶，由於與中心法則中的從DNA到RNA的轉錄是反向的，所以稱為反轉錄酶（reverse transcriptase）。
反轉錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補的DNA鏈。像其他DNA聚合酶一樣，反轉錄酶也以5′→3′方向合成DNA（圖1-3）。
圖1-3 由mRNA反轉錄形成cDNA的過程
cDNA合成過程是：第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。
（三）尋根問底
1.為什麼要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內提取不行嗎？
提示：構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，並不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發育的不同階段表達的基因有什麼不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫。
2.將目的基因直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這麼做，結果會怎樣？
提示：有人採用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什麼基因導入了受體植物。此法目前爭議頗多，嚴格來講不算基因工程。
釋疑拓展1.核酸探針的標記與分子雜交
2.淺談影印平板培養法——從一道高考題談起
音頻來源：小甘老師