· 這篇論文是國內發表的學術論文中，首次提出並論證消化系統是冠狀病毒感染的潛在途徑
· 新冠病毒是和人體細胞中的血管緊張素轉換酶的受體結合進入細胞的，這種酶在呼吸系統的上皮細胞中有高表達；這項研究這分析表明，消化系統的食管、迴腸和結腸吸收性腸的上皮細胞中，也有這種酶的高表達
來自海軍軍醫大學第二、第三附屬醫院的研究人員聯合清華大學、同濟大學的研究人員，對新型冠狀病毒在消化系統的感染情況進行了研究。本研究為人們可能通過呼吸道和消化系統感染2019新型冠狀病毒提供了生物信息學證據，有助於臨床醫生預防和治療2019新型冠狀病毒感染，並能對我們制定有關預防2019新型冠狀病毒感染的健康政策產生重大影響。
與嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV）一樣，2019新型冠狀病毒也是通過細胞受體血管緊張素轉換酶2（ACE2）進入主細胞。為了分析ACE2表達細胞的組成和比例，探索2019新型冠狀病毒在消化系統感染中的可能途徑，對4組肺、食管、胃、迴腸和結腸的單細胞轉錄體進行了分析。結果表明，ACE2不僅在肺AT2細胞、食管上皮細胞和復層上皮細胞中有高表達，而且在迴腸和結腸吸收性腸上皮細胞中也有高表達。這些結果表明，消化系統和呼吸系統是2019型新冠狀病毒感染的潛在途徑。
為了探討2019新型冠狀病毒的感染途徑及ACE2在消化系統感染中的作用，我們在公共資料庫的基礎上，通過單細胞轉錄體鑑定了正常人肺和胃腸系統中ACE2表達的細胞組成和比例。一個引人注目的發現是，ACE2不僅在肺AT2細胞中表達，而且在食管上部和分層上皮細胞以及迴腸和結腸吸收性腸上皮細胞中也有表達。此外，2019新型冠狀病毒的腸道症狀可能與侵襲的ACE2的腸表達細胞有關。這些發現表明，消化系統和呼吸道可能是2019新型冠狀病毒感染的潛在途徑。
摘要（Abstract）
自從2019年12月起，一種新型冠狀病毒（2019新冠狀病毒，2019-nCov）在中國湖北省最大省份之一——武漢，引起了肺炎的爆發，並引起了對公共衛生事件的重大關注。與嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV）一樣，2019新型冠狀病毒也是通過細胞受體血管緊張素轉換酶2（ACE2）進入主細胞。為了分析ACE2表達細胞的組成和比例，探索2019新型冠狀病毒在消化系統感染中的可能途徑，對4組肺、食管、胃、迴腸和結腸的單細胞轉錄體進行了分析。結果表明，ACE2不僅在肺AT2細胞、食管上皮細胞和復層上皮細胞中有高表達，而且在迴腸和結腸吸收性腸上皮細胞中也有高表達。這些結果表明，消化系統和呼吸系統是2019型新冠狀病毒感染的潛在途徑。綜上所述，本研究為人們可能通過呼吸道和消化系統感染2019新型冠狀病毒提供了生物信息學證據，並可能對我們制定有關預防2019新型冠狀病毒感染的健康政策產生重大影響。
介紹（Introduction）
2019年底，中國最大城市之一——武漢出現了越來越多的不明原因肺炎患者，並迅速蔓延到全國各地。一種新型冠狀病毒隨之從人氣道上皮細胞中分離出來，命名為2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）。全基因組序列揭示了2019新型冠狀病毒與蝙蝠（bat-SL-CoVZC45，MG772933.1）中檢測到的SARS型病毒86.9%的核苷酸序列有同源性。通過成對蛋白質序列分析，結果表明2019新型冠狀病毒是SARS相關冠狀病毒（SARSr-CoV）的其中一類。
至於2019新型冠狀病毒感染的臨床表現，發熱和咳嗽是發病時最常見的症狀。此外，它經常引起嚴重的腸道症狀，如腹瀉和噁心，甚至比SARS病毒和中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）更嚴重。然而，人們對2019新型冠狀病毒引起腸道症狀的原因和方式知之甚少。此外，2019年新型冠狀病毒是否能通過呼吸道以外的消化道傳播尚不清楚。
冠狀病毒感染的前提是進入宿主細胞。在此過程中，刺針型（S）糖蛋白識別宿主細胞受體並誘導病毒和細胞膜融合。2019新型冠狀病毒感染時，一種金屬肽酶血管緊張素轉換酶II（ACE2）被證明是細胞受體，與SARS病毒感染一樣。2019新型冠狀病毒可進入ACE2的表達細胞，但不能進入沒有ACE2的細胞或具有其他冠狀病毒受體的細胞，如氨基肽酶N和二肽基肽酶。因此，ACE2在2019新型冠狀病毒感染中起著至關重要的作用。
為了探討2019新型冠狀病毒的感染途徑及ACE2在消化系統感染中的作用，我們在公共資料庫的基礎上，通過單細胞轉錄體鑑定了正常人肺和胃腸系統中ACE2表達的細胞組成和比例。一個引人注目的發現是，ACE2不僅在肺AT2細胞中表達，而且在食管上部和分層上皮細胞以及迴腸和結腸吸收性腸上皮細胞中也有表達。此外，2019新型冠狀病毒的腸道症狀可能與侵襲的ACE2的腸表達細胞有關。這些發現表明，消化系統和呼吸道可能是2019新型冠狀病毒感染的潛在途徑，將會對我們制定有關預防2019新型冠狀病毒感染的健康政策產生重大影響。
材料和方法（Materials and Methods）-數據來源（Data Sources）
肺、食道、胃、迴腸和結腸的單細胞表達矩陣來自基因表達資料庫（GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、單細胞入口（https://Single cell.broadinstitute.org/Single-u cell）和人類細胞圖譜數據入口（http://data.humancellatlas.org）。食管和肺的單細胞數據來自E. madisson等人的研究，其中包含6個食管和5個肺組織樣本。胃黏膜樣本的數據來自GSE134520的3例非萎縮性胃炎和3例慢性萎縮性胃炎患者。GSE134809由11例迴腸克羅恩病患者的22個迴腸樣本組成，僅選擇非炎症樣本進行分析。Christopher S等人的研究包括12個正常結腸樣本。
質量控制（Quality Control）
去除表達基因低於200或大於5000的低質量細胞。我們進一步要求線粒體或核糖體基因的UMIs比例低於20%。
數據集成、降維和單元聚類（Data Integration, Dimension Reduction and Cell Clustering）
根據下載的數據，對不同的單細胞項目進行了不同的數據處理方法。
食道和肺數據集：Seurat rds數據直接從E.madisson al的研究補充材料中下載。採用均勻流形近似和投影（UMAP）可視化方法獲得細胞簇。
胃和迴腸數據集：用R安裝包Seurat（3.0版）處理單細胞數據表達矩陣。我們首先利用「歸一數據」 規則和單細胞基因表達數據。將UMI計數標準化為每個單元的UMI總數，乘以10000進行標準化，並轉換為對數轉換計數。利用Find Variable Genes（發現變量基因）功能鑑定高變基因（HVGs）。然後，我們使用Find Integration Anchors和Integrate data函數合併每個數據集中的多個樣本數據。在去除單個細胞數據集中不需要的變異源（如細胞周期階段或線粒體汙染）後，我們使用RunPCA函數對具有顯著HVGs的單個細胞表達矩陣執行主成分分析（PCA）。然後利用Find Neighbors函數構造了PCA空間中基於歐幾裡德距離的K近鄰圖，並利用最優解析度的Find Clusters函數將Louvain算法應用於迭代群單元。UMAP用於可視化目的。
結腸數據集單細胞數據表達矩陣用R安裝包LIGER和Seurat處理。我們首先將數據標準化，以解釋細胞間測序深度和捕獲效率的差異。然後利用select Genes函數分別識別每個數據集上的可變基因，並對結果進行聯合。下一步，使用LIGER中的優化函數，進行整合的非負矩陣因子分解，以識別數據集中的共享和不同的基因，以及每個細胞對應的因子負荷。我們選擇k為15，lambda為5.0，得到一個期望的對齊圖。然後，我們使用quantile Align SNF函數確定了在數據集之間共享的集群，並在每個集群和因子中對齊了分位數。接下來在Seurat中使用RunUMAP函數進行非線性降維，並用UMAP顯示結果。
細胞類型鑑定及基因表達分析（Identification of cell types and Gene expression analysis）
我們根據已知細胞標記的表達和文章中提供的聚類信息來標註細胞簇。然後我們在Seurat中使用「RunALRA「功能將缺失的值輸入scRNA-seq數據中。利用Seurat繪製特徵圖和小提琴圖，顯示輸入的基因表達。為了比較不同數據集中的基因表達，我們在R安裝包預處理（R包版本1.46.0 https://github.com/bmbolstad/preprocessCore）中使用了「分位數標準化」對數據進行預處理。然後對基因表達數據進行進一步的去噪處理，對正態分布進行隨機生成，平均值等於平均值，標準差等於標準差。
結果（Results）-單元類型注釋（Annotation of cell types）
胃腸系統由食道、胃、迴腸、結腸和盲腸組成。在這項研究中，我們分析了4個數據集，包括食道、胃、迴腸和結腸的單細胞轉錄體，以及肺（附件）。在細胞遊程輸出的基礎上，利用基因表達計數矩陣，根據不同的器官或特定的細胞簇來呈現細胞的序列聚類。每個簇中的細胞類型標識由已知細胞類型標記的表達式進行注釋。
在食管中，通過87947個細胞鑑定出14種細胞類型。90%以上的細胞分為四種主要的上皮細胞類型：上、復層、基底上和基底上的分裂細胞（圖1A）。上皮基底層的附加細胞更接近於腺管和粘液分泌細胞。淋巴管和內皮細胞與血管組織有關。食道中的免疫細胞包括T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dc）和肥大細胞。
經質量控制，共鑑定出29678個細胞和10種細胞類型，其中胃上皮細胞比例較高，包括胃竇基底腺粘液細胞（GMCs）、胃底粘液細胞（PMCs）、主細胞和腸內分泌細胞（圖1B）。非上皮細胞系由T細胞、B細胞、髓細胞、成纖維細胞和內皮細胞組成。
質量控制後，迴腸中有50286個細胞和10種細胞類型（圖1C）。檢測細胞類型包括上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞和腸內分泌細胞。所鑑定的免疫細胞類型包括髓樣細胞、CD4+T、CD8+T和自然兇手T（NKT）細胞，以及血漿和B細胞。在11218個上皮細胞中，共鑑定出5種細胞類型，即吸收型腸上皮細胞、前體吸收型腸上皮細胞、杯狀上皮細胞、盤狀上皮細胞和未分化上皮細胞（圖1D）。
所有來自結腸的47442個細胞在質量控制後都進行了注釋（圖1E）。上皮細胞中有吸收和分泌簇。吸收簇包括運輸放大（TA）細胞（TA 1，TA 2）、未成熟腸細胞和腸細胞的進一步子簇。分泌簇包括祖細胞（分泌TA，未成熟杯狀細胞）和成熟細胞（杯狀細胞和腸內分泌細胞）的子簇。在最後的UMAP中還發現了神經節細胞和循環TA細胞。
細胞類型特異性ACE2表達（Cell type-specific ACE2 expression）
關於胃，ACE2在所有簇中的表達相對較低（圖2B，C）。選定的細胞類型特異性標記基因用於識別胃中的每個簇（圖2C）。MUC6和TIFF1在所有的簇中都高度表達。PGA4與CHGB、CD34、CD79A、CD8A和PRF1、VCAN和COL1A1、CD79A和CD79A、CD8A和PRF1、CD79A和CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、CD79A、。
至於食道，ACE2在上皮細胞的上層和分層中高度表達（圖3B，C）。腺體中ACE2的表達也很低（圖3C）。所選的細胞類型特異性標記基因用於識別食道中的每個簇（圖3C）。ECM1在上皮細胞中高表達。KRT4和krt5主要存在於復層上皮細胞中。KI67用於鑑別上皮細胞分裂，MUC5B和KRT23用於腺體，COL1A1和DCN用於基質細胞，VWF和PECAM1用於淋巴管和內皮細胞。用TPSB2、FCN1、CD79A、GNLY、CD27和CD3E作免疫細胞，如髓細胞、DC、B、T和肥大細胞。
在迴腸上皮細胞中，ACE2在吸收性腸細胞中高表達，在祖細胞中低表達，這與結腸中的類似（圖4B，C）。所選的細胞類型特異性標記基因也被用於鑑定迴腸上皮細胞（圖4C）。SEC2A5主要存在於腸吸收細胞和前體吸收細胞中。除吸收性腸上皮細胞外，其餘上皮細胞均可見CD24。MII67和AMACR分別在未分化細胞和Paneth細胞中高表達。BCAS1用於鑑定未分化細胞，AMACR用於Paneth。
在結腸中，ACE2主要存在於腸細胞中，在未成熟腸細胞中表達較少（圖5B，C）。選定的細胞類型特異性標記基因用於識別結腸中的每個簇（圖5C）。AQPB主要存在於腸上皮細胞和未成熟腸上皮細胞中。此外，ZG16和ITLN1在杯狀物和未成熟杯狀物中高度表達。APOE在TA2和分泌型TA中均有表達。CD27和TPH1檢測腸內分泌，SPC25檢測TA循環。在最初的質量控制之後，在肺中識別出57020個細胞和25種細胞類型（圖6A）。檢測到的細胞類型包括纖毛細胞、肺泡1型（AT1）和肺泡2型（AT2）細胞、成纖維細胞、肌肉細胞和內皮細胞。所鑑定的免疫細胞類型為T、B和NK細胞，以及巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞（DC）。ACE2主要在AT2細胞中表達，在AT1和成纖維細胞中也有表達（圖6B）。
在正常消化系統和肺的所有ACE2表達細胞中，迴腸和結腸的ACE2表達高於肺和食管（圖6C）。
Discussion（討論）
冠狀病毒是人類和其他哺乳動物上呼吸道、胃腸道和中樞神經系統的常見感染源。二十一世紀初，SARS-CoV和MERS-CoV兩種β-冠狀病毒引起了持續的公眾恐慌，成為最重要的公共衛生事件。2019年12月，一種新發現的冠狀病毒（2019-nCov）在中國湖北武漢引發了一場持續的肺炎爆發，感染人數不斷上升。到目前為止，其感染途徑和消化系統感染尚不清楚。在本研究中，我們發現2019新型冠狀病毒的細胞進入受體ACE2在肺AT2細胞、食道上層上皮細胞和分層上皮細胞以及迴腸和結腸的吸收性腸上皮細胞中高表達，表明不僅呼吸系統而且消化系統是潛在的感染途徑。此外，2019新型冠狀病毒的腸道症狀可能與侵襲的表達ACE2的腸細胞有關。
一般來說，許多呼吸道病原體，如流感、SARS-CoV和SARSr-CoV，都會引起腸道症狀，2019新型冠狀病毒也是如此。SARS作為一種典型的呼吸道冠狀病毒，常與呼吸道症狀一起引起腸道症狀。此外，大便傳播也是SARS被忽視的風險。在SARS和流感高致病性菌株感染期間，它們的腸道症狀與腸道脂多糖（LPS）通透性增加和細菌通過胃腸壁的傳播有關。但2019新型冠狀病毒引起腸道症狀的機制尚不清楚。
最近的一項研究顯示，與SARS病毒和MERS病毒相似，ACE2是2019新型冠狀病毒的細胞進入受體。以前，ACE2是從SARS病毒許可的Vero E6細胞中分離出來的。它可以與SARS冠狀病毒CTD1的受體結合區（RBD）相互作用，促進有效的跨物種感染和人與人之間的傳播。CTD1的「向上」和「向下」轉變通過調節CTD1、CTD2、S1-ACE2複合物和S2亞單位之間的關係來允許ACE2結合。在人HeLa（海拉癌細胞株）細胞方面，從人、麝貓和中國馬蹄蝠中表達ACE2可以幫助多種SARSr病毒，包括2019新型冠狀病毒進入細胞，表明ACE2在細胞進入中的重要作用。在治療上，抗ACE2抗體可以阻斷病毒在Vero E6細胞上的複製。
通過分析ACE2在正常人胃腸系統和肺組織中的表達，我們發現ACE2在肺AT2細胞、食管上皮細胞、復層上皮細胞和迴腸、結腸吸收性腸上皮細胞中有高表達。與之前的研究相似，ACE2在AT2細胞中表達較多，而在正常肺的AT1細胞中表達較少。在肺泡中，AT1上皮細胞負責氣體交換，AT2細胞負責表面活性劑的生物合成和自我更新。在SARS病毒感染中，AT2是病毒抗原和分泌囊泡檢測的主要感染細胞類型。它在AT2細胞中的表達在不同的供體中是可變的，這可能與不同的易感性和嚴重性有關。因此，我們認為AT2細胞可能是肺中2019新型冠狀病毒侵入細胞的關鍵，其數量可能與呼吸系統症狀的嚴重程度有關，這可以解釋無症狀的2019新型冠狀病毒攜帶者的存在。
ACE2在食管上皮細胞中也有高表達。組織學上，食道和呼吸系統器官，如氣管和肺，都起源於中段前腸的前部。在與鄰近的呼吸系統分離後，食道隨後經歷簡單的柱狀到復層鱗狀上皮轉化的形態發生。復層鱗狀上皮可由黏膜下腺體滋養，並維持研磨性生食的通過。在Barrett食管（BE）中，酸反流引起的食管炎和多層上皮（MLE）與上上皮細胞和復層上皮細胞均相關。
在消化系統中，除食管上皮細胞和復層上皮細胞外，迴腸和結腸吸收性腸上皮細胞中也發現ACE2，這是最脆弱的腸上皮細胞。在微生物感染中，腸上皮細胞起屏障作用，有助於協調免疫反應。吸收性腸細胞可被冠狀病毒、輪狀病毒和諾如病毒感染，通過破壞吸收性腸細胞、吸收不良、腸分泌不平衡和激活腸神經系統而導致腹瀉。因此，我們認為腹瀉的腸道症狀可能與侵襲的表達ACE2的腸細胞有關。此外，由於細胞受體ACE2在食管上部和分層上皮細胞以及迴腸和結腸吸收性腸上皮細胞中的高表達，我們推測2019新型冠狀病毒可侵入消化系統並作為感染途徑。
結論（Conclusion）
本研究為人們可能通過呼吸道和消化系統感染2019新型冠狀病毒提供了生物信息學證據，有助於臨床醫生預防和治療2019新型冠狀病毒感染。
通訊作者：Hao Zhang，海軍軍醫大學第二附屬醫院
發布日期：2020年1月31日
發布渠道：bioRxiv
原文地址：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.01.30.927806v1
原文標題：The digestive system is a potential route of 2019-nCov infection: a bioinformatics analysis based on single-cell transcriptomes
譯者：小碩 | 網易公開課