我常常羨慕孩子眼中的二元世界，非黑即白，好人和壞人，美麗和醜陋，對事物的判斷不會有絲毫猶豫。對於檢測結果大多數也是二元的，陽性或陰性。可是成人的世界裡哪有那麼簡單，弱陽性或者可疑的檢測結果作為一種處於量子狀態的比「薛丁格的貓」還神秘的陽性分分鐘讓檢測人員懷疑人生。今天結合我的一些經驗，跟大家一起分享一些弱陽性樣品判讀的原則。
一、排除汙染和非特異擴增
本文討論的所有前提都是建立在實驗室處於一個正常受控的狀態下，檢測的各個環節都經過驗證，檢測結果準確可靠。
這部分的內容大家可以查閱本公眾號的#檢測全流程質控控制系列#文章。
預防核酸汙染可參考如何預防和處理PCR檢測實驗室的核酸汙染？
實驗室建設可參考醫學實驗室設計與建設基本要求
防止假陽性結果參考核酸檢測中的假陽性與假陰性之辨！
二、檢測陽性結果的確認
嚴格按照試劑說明書和SOP操作，保證檢測結果的準確性，這樣即使出現弱陽性結果也可以確定是陽性，有條件的可以使用更精確的方法進行確認，如螢光定量PCR的結果可以使用數字PCR進行確證。
1拷貝模板的檢測
三、評估檢測系統的最低檢測限
1.LOB、LOD和LOQ
每一個檢測體系都有其固有的性能，因此需要使用標準物質或標準樣品盤對檢測系統進行評估，以確定其LOB、LOD和LOQ。對於qPCR和ELISA等定性方法需要LOB和LOD的評估，對於定量方法需要LOB、LOD和LOQ的評估。
LOB(Limit of blank), 空白檢測限，指用空白樣本去測試，在一定的概率下能測得的最高測量結果。
LOD(Limit of detection), 最低檢測限，通常指對低濃度的分析物樣本進行測試，在一定的概率的條件下能測得的最低值。
LOQ(Limit of quantitation), 定量限，通常指用低濃度的分析物樣本進行測試得出的較低的值，這個值的準確性是有要求的，就是不光要能測到，而且還要保證結果是準確的。
當樣品濃度低於LOB是無法檢出的；
當樣品濃度高於LOB而低於LOD，是無法穩定檢出的，檢出即為陽性；
當樣品濃度高於LOD而低於LOQ，可穩定檢出的，無法準確定量；
當樣品濃度高於LOQ可精確定量。
2.核酸檢測的LOD
可參照診斷試劑評價系列2-核酸檢測方法（更正）
3.血清學檢測的LOD
可參照診斷試劑評價系列3-血清檢測方法
四、確定檢測樣品中的病毒含量
檢測就像用秤去秤東西，首先要知道秤的量程，最低就是LOD了，然後需要大致了解要稱量的東西的大概重量，是棉花、木頭還是鋼材，非要用稱鋼材的秤去稱少量的棉花那結果也一定是不準的，或者你明明把棉花放到秤上了但是顯示是零。這就不是檢測的問題而是試驗設計的問題。但是現實是我們檢測實驗室被要求必須用高性價比（便宜）的試劑盒去測每毫升幾個拷貝的病毒，還要求我們給出明確的結果。所以才有了本文對弱陽性樣品的強行判定。不同類型樣品病原含量可以從文獻、同行交流或者歷史檢測數據獲得相關信息。
引自（Pan Y, et al. Viral load of SARS-CoV-2 in clinical samples.The Lancet Infectious diseases ）
五、儘量一網打盡所有病原
對於核酸檢測來說模板含量越低能檢測到的概率就越低，因此LOD通常為95%的概率可以檢出，但是我們遇到的情況是需要我們判定模板含量高於LOB而低於LOD的部分。
如下圖，50微升的核酸中一共只有3個模板，如何能保證檢測到模板？這其實是一個很不專業的問題，標準答案是如果我的試劑盒的LOD是200 copie/mL,樣本中模板含量只有60 copie/mL，我當然檢測不到了。很不湊巧你的老闆不懂專業，必須要你給出結果，樣品中到底有沒有模板？我的建議是多次採樣檢測和將每次50微升的核酸全部進行擴增，有2次檢測為陽性基本可以確認樣品中含有模板。
六、選擇合適的試驗策略
1.平行試驗 Parallel test：
多個檢測項目，只要有一個陽性即診斷為陽性，此法提高了敏感性，但降低了特異性，即減少漏診率，提高了誤診率。當漏掉一個陽性後果嚴重時或再進行篩檢費人力、物力時，要儘量減少漏診率，則可採取平行試驗。俗話說就是寧可錯殺一千不放掉一個。但是當進行足夠多的平行試驗時，每份樣品都是「陽性」。
2.序列試驗 Serial test：
多個檢測項目，必須全部為陽性才能診斷為陽性。此法可以提高特異性，降低了敏感性，即減少誤診率，但卻增加了漏診率，當誤診能造成嚴重後果，如不必要的、昂貴的或者有創治療時，應該用序列試驗。但是當進行足夠多的序列試驗時，每份樣品都是「陰性」。
七、結合臨床的實際情況
同時對同一宿主的不同部位（如鼻拭子、口腔拭子、全血、肛門拭子、精液等）採樣檢測；
過一段時間後進行採樣複測；
結合同群動物的檢測情況；
結合核酸檢測和抗體檢測結果；
技術手段和風險管理手段相結合。
小結：本文的一些內容有點違背檢測的原則和科學規律，但是我們檢測人又不得不面對和解決這樣棘手的問題。希望本文能對有這方面困惑的同仁有所幫助。
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