2020年11月10日，浙江大學腦科學與腦醫學學院羅建紅、李相堯教授團隊及上海交通大學醫學院解剖學與生理學系徐天樂教授團隊合作在《Cell Reports》雜誌發表題為Restoration of Cingulate Long-Term Depression by Enhancing Non-apoptotic Caspase 3 Alleviates Peripheral Pain Hypersensitivity的最新研究論著[2]，揭示了Casp3通過與AMPA受體亞基的相互作用參與了前扣帶回皮層LTD，闡明了Casp3分子的非凋亡功能與前扣帶回皮層LTD以及神經病理性疼痛之間的作用機制。
Casp3參與周圍神經損傷抑制ACC腦區LTD誘導過程
首先，作者在成年雄性小鼠上構建腓神經結紮模型（peroneal nerve, CPN）[3]，發現，CPN結紮可顯著降低機械縮足反應閾值（paw withdrawal threshold, PWT），同時，在術後7天記錄ACC的場電位發現，周圍神經損傷減弱了ACC中長時程抑制（long-term depression, LTD）的誘發（圖1A-C）。AMPA受體（AMPAR）的內化過程參與LTD的誘發表達，AMPAR的內化則需要激活Caspase 3（Casp3）[4-6]。因此，為了明確周圍神經損傷抑制LTD誘發的機制，研究人員先驗證了Casp3是否參與ACC中LTD的誘發。他們在ACC中檢測到了Casp3陽性神經元（圖1D），此外，藉助Casp3抑制劑（Z-DEVD-FMK）發現，在低頻電刺激（low-frequency stimulation, LFS；1Hz）前20min給予抑制劑，可阻斷LTD的誘發，但不影響長時程增強（long-term potentiation, LTP）的誘導（圖1E,F）。同時，給予腦切片Casp3激活劑（cisplatin）處理後，突觸後緻密物（postsynaptic densities, PSDs）中GluA1和GluA2蛋白亞基（編碼AMPA受體的重要基團）含量顯著下降，這一現象可被Casp3抑制劑所逆轉（圖1G,H），這進一步提示了，Casp3在調節AMPAR內化過程中的重要作用。圖1 周圍神經損傷抑制LTD的誘發，Casp3參與ACC中LTD的誘發過程
Casp3通過高度保守序列—D604與AMPA受體亞基發生相互作用
基於圖1的數據，Casp3在PSDs中調控AMPAR亞基，提示了Casp3可能在興奮性突觸中表達。同時，藉助免疫電鏡技術（immuno-electron microscopy，IEM）發現Casp3同時存在於ACC興奮性突觸前和突觸後區域（圖2A）。為明確Casp3和AMPAR亞基之間存在相互作用關係，作者進一步藉助caspase資料庫、免疫共沉澱（co-IP）技術及電生理記錄發現，在AMPAR亞基中高度保守序列—D604介導了Casp3和AMPAR亞基之間的相互作用，因此藉助D604阻斷兩者之間的相互作用可抑制AMPAR的內化及LTD誘發（圖2）。圖2 D604序列可部分阻斷Casp3和AMPAR亞基之間的相互作用
Western blotting結果顯示，CPN結紮後第7天和第14天ACC中正常狀態下和活化後的Casp3含量均顯著下降（圖3A-C）。進一步，研究人員探討了在周圍神經損傷後Casp3調控通路是否也發生了改變。Casp3所調控的細胞凋亡可由兩種方式進行調控：外源性途徑（Extrinsic pathway）和內源性途徑（Intrinsic pathway）[7]。外源性途徑是通過配體與細胞表面受體結合，如TFN受體1（TNFR1）和死亡受體Fas/CD95，在FADD（Fas偶聯死亡區域蛋白Fas-associated death domain protein）的協助下，FADD的死亡效應區和Caspase 8酶原結合，隨後通過高密度自催化激活自身，活化後的Caspase 8激活下遊的Caspase 3，導致細胞凋亡（圖3D）。作者檢測了CPN結紮後不同時間點的扣帶皮層中Fas、TNFR1和Casp8的表達，結果發現，發現TNFR1和Fas從周圍神經損傷後第7天開始表達下調（圖3E, F），而Casp8從第14天開始下降（圖3G）。內源性途徑源於DNA損傷，導致線粒體膜通透性改變，釋放出細胞色素C（Cytochrome C），激活Casp9，進而去調控下遊Casp3（圖3D）。Western blotting結果顯示，周圍神經損傷後ACC中Casp9（圖3H）和細胞色素C（圖3I）含量無明顯變化。這提示了，CPN結紮可能影響ACC中Casp3調控通路的外源性途徑。圖3 周圍神經損傷導致Casp3表達下調及其調控的外源性途徑改變
接下來，作者驗證了Casp3的表達下調對於周圍神經損傷導致LTD抑制的作用。研究人員設計了Casp3的特異性shRNA，並藉助慢病毒載體（Lenti-CMV-EGFP-U6-Casp3 shRNA）在小鼠ACC中特異性下調Casp3的表達（圖4A, B），同時發現，Casp3表達下調後可明顯抑制LTD誘導（圖4C,D）。進一步，研究人員同樣藉助慢病毒載體（Lenti-hSyn-Casp3-mCherry）特異性在ACC中過表達Casp3（圖4E），病毒注射10天後進行CPN結紮，一周後區ACC腦片觀察發現，ACC腦區Casp3表達升高後逆轉了CPN結紮導致的LTD誘導受到抑制的現象（圖4F-H）。圖4 Casp3含量變化改變了ACC中LTD的誘導
隨後，作者探究了Casp3表達下調是否會影響突觸增強。Western blotting結果顯示，CPN結紮導致PSDs中GluA1水平升高（圖5A），同時，注射Lenti-CMV-EGFP-U6-Casp3 shRNA的小鼠PSDs中GluA1和GluA2水平也升高（圖5B），全細胞膜片鉗記錄顯示，自發性興奮性突觸後電流（spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs）的振幅明顯升高，而頻率無明顯變化（圖5C-E），這提示了，Casp3的表達下調增加ACC中AMPAR介導的電流。有意思的是，周圍神經損傷後，ACC腦區中Casp3的過表達使PSDs中GluA1和GluA2含量下降（圖5F），全細胞膜片鉗記錄顯示，CPN結紮後Casp3過表達導致sEPSCs的平均振幅下降（圖5G-I）。CPN結紮組和對照組AMPAR介導的輸入/輸出電流曲線存在顯著差異，而ACC腦區Casp3過表達則消除了這種差異（圖5K,L），這提示了Casp3的過表達有效阻止了損傷導致的ACC興奮性突觸中功能AMPARs的上調。圖5 ACC腦區Casp3的表達下調增強了AMPAR電流，同時，Casp3的過表達可逆轉CPN結紮導致的突觸傳遞增強現象
最後，作者探討了Casp3的下調是否會導致類似的慢性疼痛表型。研究人員藉助Von Frey纖維細絲觸痛儀檢測機械性痛覺超敏（mechanical allodynia, 一種與慢性疼痛相關的病理現象），發現下調Casp3表達可降低小鼠機械縮足反應閾值（paw withdrawal threshold, PWT）（圖6A）。自發性疼痛（Spontaneous pain）是另一種與慢性神經疼痛相關的病理表象，研究人員藉助條件性位置偏愛行為學範式發現，腹腔注射腎上腺素能受體a2亞基激動劑可誘導ACC中Casp3敲低小鼠的位置偏好（圖6B）。同時，作者還探討了幹擾AMPAR內化是否會導致外周過敏反應（peripheral hypersensitivity），將D604作用於野生小鼠ACC腦區，可降低小鼠PWTs，並顯著誘導小鼠條件性位置厭惡（conditioned place aversion, CPA）（圖6C,D）。上述結果顯示，過表達Casp3可降低了神經損傷後興奮性突觸傳遞，保護LTD誘導，基於此，作者研究了Casp3的高表達是否會影響神經損傷後的疼痛表現，結果顯示，Casp3的表達上調並未改變小鼠的PWTs（圖6E,F），但可改善CPN結紮後的冷觸誘發痛（圖6G,H），提示了，Casp3可改善小鼠的痛覺過敏。此外，CPN結紮後，腎上腺素能受體a2亞基激動劑可誘導小鼠的位置偏好，這一現象也可被高表達的Casp3所逆轉（圖6I），提示了Casp3也可改善自發性疼痛。此外，作者通過Ca2+滲透型AMPAR（CP-AMPARs）選擇性抑制劑處理後發現，CPN結紮小鼠在抑制劑處理1h後表現出PWTs升高及位置偏好現象（圖6K,L），這些數據表明，經CP-AMPARs抑制劑處理可逆轉神經損傷引起的AMPARs活性增強現象。圖6 過表達Casp3可緩解神經損傷後的痛覺過敏
本篇文章結合病毒載體介導的基因過表達/幹擾、膜片鉗電生理、免疫電鏡、免疫共沉澱、行為學等多種技術手段發現，Casp3通過與AMPA受體亞基的相互作用參與了前扣帶回皮層LTD，Casp3的下調抑制了ACC中的LTD誘發，導致痛覺過敏，而過表達Casp3可降低神經損傷後的外周痛覺過敏現象。這些研究闡明了Caspase3分子的非凋亡功能與前扣帶回皮層LTD以及神經病理性疼痛之間的作用機制，為治療神經病理疼痛提供新方向！
和元生物有幸提供實驗中使用的慢病毒載體（Lenti-hsyn-Casp3-P2A-mCherry、Lenti-CMV-EGFP-U6-Casp3 shRNA），用實際行動助力中國腦科學的發展。
●【Nat Commun.】陸軍軍醫大學張駿課題組揭示下丘腦orexin神經系統在REM睡眠穩定維持中的重要作用
●【Nat Commun.】泰山壓頂！潘秉興研究組揭示壓力引發焦慮的環路機制！
●【Cell】神經所楊輝/周海波團隊揭秘膠質細胞轉分化為神經元的奧秘
●【Sci Adv.】北京大學萬有/伊鳴教授團隊藉助CRISPR-SaCas9系統精準「刪除」動物特定記憶
●【Autophagy】神智之蝕！浙江大學周舟研究組揭示TMT誘導神經毒性的分子機制！
●【Cell Stem Cell】AD細胞療法！王建枝團隊揭示pTau蛋白異常聚積破壞海馬神經發生的微環境機制
●【Nature子刊】不做「最熟悉的陌生人」，上海交通大學徐楠傑/孫蘇亞課題組合作發現初始社交記憶形成的分子機制
●【Nature子刊】管吉松課題組揭示了ASH1L基因突變誘發圖雷症候群的可能分子機制
●【Nat. Commun.】中山大學信文君教授團隊最新研究發現CircAnks1a參與調控神經病理性疼痛的新機制
●J Pineal Res：不能承受之「重」，周舟課題組揭示褪黑素通過調控SERPINA3N依賴性神經炎症拮抗TMT引起神經毒性
●【Mol Psychiatry】師蕾/蔣斌課題組揭示自閉症易感基因DOCK4調控社交行為的分子及細胞機制
●【Nat. Neurosci.】您還在害怕社交嗎？空軍軍醫大學武勝昔研究組揭示社交恐懼的罪魁禍首！
●科學新發現：克服「全民焦慮症」！韓峰團隊揭示調控焦慮行為的新機制
●【Neuron】癢並快樂著！徐天樂研究組揭示抓癢引起愉悅感的中樞神經環路機制
●Tau蛋白如何影響記憶？王建枝、劉恭平合作研究揭示阿爾茨海默病的潛在臨床治療靶點
●【Neuron】不只是害羞！浙大徐晗教授最新研究揭示社交恐懼的神經微環路機制
●【Science 重磅】如何喚醒沉睡的你
●【Science】除了覺醒，丘腦如何控制聯合學習
和元生物一直致力為神經科學研究提供整體研究方案，從標記、示蹤、基因操作、生理操作到觀察，提供病毒包裝、動物模型構建、病理研究等一站式服務。用實際行動助力中國腦科學的發展！參考文獻
[1] Bliss,T.V. et al., (2016). Synaptic plasticity in the anterior cingulate cortex in acute and chronic pain. Nat. Rev. Neurosci. 17, 485–496.
[2] Yong-Jie Wang. et al., (2020). Restoration of Cingulate Long-Term Depression by Enhancing Non-apoptotic Caspase 3 Alleviates Peripheral Pain Hypersensitivity. Cell Rep. 2020 Nov 10;33(6):108369. doi: 10.1016/j.celrep.2020.108369.
[3] Li, X.-Y. et al., (2010a). Alleviating neuropathic pain hypersensitivity by inhibiting PKMzeta in the anterior cingulate cortex. Science 330, 1400–1404.
[4] Li, Z. et al., (2010b). Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell 141, 859–871.
[5] Han, M.H. et al., (2013). The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol. Cell. Proteomics 12, 3719–3731.
[6] Ert€ urk, A. et al., (2014). Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms.J. Neurosci. 34, 1672–1688.
[7] Hollville, E., and Deshmukh, M. (2018). Physiological functions of nonapoptotic caspase activity in the nervous system. Semin. Cell Dev. Biol. 82,127–136.