作者： 李暉 李詠茵 張志高 盧振 王奕 林冠峰
安泰學 胡秀梅 賴欽濤 易璇 劉智泓 翟向明
孫劍 郭亞兵 陸家韜 張小勇 吳英松 侯金林
中華傳染病雜誌, 2020,38： 網絡預發表. DOI: 10.3760/cma.j.cn311365-20200221-00101
轉載自：檢驗科空間
新型冠狀病毒肺炎疫情發生以來，在全國迅速蔓延，嚴重威脅著人民群眾的生命安全和身體健康[1,2]。國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》中以實時螢光反轉錄PCR和病毒基因測序為病原學確診證據[3]。由於採樣、操作以及試劑等多方面因素影響，核酸檢測會出現假陰性結果，目前已有回顧性數據表明，高度疑似2019新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus, 2019-nCoV）感染患者的病毒核酸陽性檢出率僅為30%～50%[4]。另外，核酸檢測對儀器設備、檢測場地及環境條件要求高，需要熟練培訓的技術人員進行操作，存在檢測時間長、通量低等缺點，不便於目前疫情下的人群大規模檢測。因此，迫切需要研發出一種快速便捷檢測試劑盒用於臨床檢測，篩選出潛在的病毒陽性感染者，從而儘快隔離感染人群以阻斷病毒傳播。
為了研製出靈敏度和特異度高，且滿足臨床檢測需求的快速便捷檢測試劑，本研究通過原核表達載體表達2019-nCoV病毒核蛋白，分別建立間接免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M和IgG快速檢測膠體金分析試劑，並對其進行臨床性能評價，評估設計的膠體金檢測試劑在2019-nCoV感染者中的陽性檢出率以及在對照人群中的假陽性率是否滿足臨床檢測需求，為2019-nCoV感染的診斷手段提供更多依據。
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對象與方法
一、研究對象
收集2020年2月12日20日在武漢市漢口醫院就診患者54例和洪湖市人民醫院就診的患者224例，參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》的診斷標準[3]，根據流行病學史、臨床表現、血常規、影像學檢查以及患者咽拭子2019-nCoV核酸反轉錄PCR檢測的結果，分為2019-nCoV核酸陽性的確診患者89例；2019-nCoV核酸陰性的疑似患者189例。另選取2015年至2018年南方醫科大學南方醫院就診的體檢者273名作為對照。
二、材料試劑
DH5α感受態細胞、BL21(DE3)感受態細胞、原核表達載體p ET32a (+)由本課題組實驗室保存；硝酸纖維素膜（型號為CN140）購自德國Sartorius stedim公司；聚氯乙烯膠板、吸水墊（ABP-S370）及玻璃纖維（SAP-Z80B）購自懷遠縣通成紙製品有限公司；氯金酸（520918-1G）購自西格瑪奧德裡奇（上海）貿易有限公司；塑料卡殼購自寧波市海曙順源塑料廠；pMD-19T（6013），PrimeSTAR Max DNA Polymerase（R045Q）及PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA合成試劑盒（6210A）寶生物工程（大連）有限公司；無縫克隆試劑盒（ZC231)購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；鼠抗人IgM單克隆抗體（A37130）及抗人IgG單克隆抗體（A37420）購自美國Biospacific公司；羊抗鼠IgG多克隆抗體（610-1103）購自美國Rockland公司；其餘試劑均為分析純。
三、2019-nCoV病毒重組核蛋白抗原的製備
2019-nCoV RNA基因組由中山大學達安基因股份有限公司惠贈。採用隨機引物進行反轉錄後獲取總cDNA。根據GenBank資料庫(基因組序列號為MN908947.3)公布的相關序列信息，設計病毒重組核蛋白（N蛋白）基因特異性引物(NP正向引物為5』-ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATC-3』；NP反向引物為5』-TTA GGCCTGAGTTGAGTCAGC -3』)，並進行PCR擴增獲得N蛋白全長序列。隨後回收PCR產物裝載於pMD-19T質粒後轉化DH5α感受態，挑取陽性克隆測序鑑定。設計同源臂引物（NP32正向引物為5』-AGCTCCGTCGACAAGCTTGCATGTCTGATAATGGACCCCAAAAT-3』；NP32反向引物為5』-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCGGCCTGAGTTGAGTCAGCACT-3』），以pMD-19T/N為模板進行PCR擴增，回收產物並裝載p ET32a (+)質粒。經測序鑑定後，將重組p ET32a/N質粒轉化入大腸埃希菌BL21 (DE3)感受態細胞中，於37 ℃振蕩培養至光密度值為0.4～0.6後，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導過夜。重組2019-nCoV N蛋白抗原純化後，採用2019-nCoV陽性血清進行蛋白質印跡法鑑定，之後4 ℃保存備用。
四、膠體金的製備
採用檸檬酸三鈉還原法，取質量分數為0.01％的氯金酸水溶液100 mL，加熱至沸騰，快速加入1.75 mL的1%檸檬酸三鈉，反應10 min冷卻後將溶液倒入潔淨玻璃器皿，採用分光光度計測定製備的膠體金的最大吸收峰值，於4 ℃存放備用。
五、鼠抗人IgG及IgM單克隆抗體-膠體金結合物製備
膠體金溶液（100 mL）中加入2 mL碳酸鉀溶液（0.1 mol/L）並攪拌均勻，再向其中加入1 mg鼠抗人IgG單克隆抗體，反應15 min後再向其中加入10%牛血清白蛋白溶液10 mL，封閉10 min，將上述抗體標記好的膠體金溶液轉移至離心管中，4 ℃ 10 000 r/min，離心半徑為10 cm，離心30 min，棄除上清液，加入3 mL的pH為8.2的PBS（0.02 mol/L，含1%牛血清白蛋白）溶液來復溶沉澱，4 ℃保存備用。採用相同方法對鼠抗人IgM單克隆抗體進行膠體金標記。
六、樣品墊及結合墊的製備
玻璃纖維膜放置於浸泡液30 min後取出，37 ℃烘箱中乾燥18 h後按樣品墊規格裁剪，乾燥密封室溫保存。將製備的鼠抗人IgG及IgM單克隆抗體-膠體金結合物噴塗至製備好的玻璃纖維膜上，37 ℃烘箱中乾燥18 h後取出，乾燥密封室溫保存。
七、硝酸纖維素膜的包被
將2019-nCoV N蛋白抗原濃度配製成2 mg/mL，按0.1 μL/mm劃線量在硝酸纖維素膜上製備檢測T線；將羊抗鼠IgG多抗濃度配製成2 mg/mL，按0.1 μL/mm劃線量在硝酸纖維素膜上製備質控C線；37 ℃烘箱中乾燥18 h後，乾燥密封，室溫保存。
八、試劑卡組裝
在乾燥室中將硝酸纖維素膜、吸水墊、膠體金結合墊、樣品墊依次粘貼在聚氯乙烯板上，切割成寬度為4.0 mm的試劑條，將試劑條裝入塑料卡內，置於含乾燥劑的鋁箔袋中，熱合封口待用。
九、檢測過程
如圖1所示，以檢測IgG為例，經1:50比例稀釋的血清樣本100 μL滴加於樣本墊，樣本向吸水材料方向流動途經膠體金結合墊時，樣本中的人抗2019-nCoV IgG抗體與膠體金標記的鼠抗人IgG單克隆抗體發生特異性結合，形成膠體金-鼠抗人IgG -人抗2019-nCoV IgG抗體複合物，複合物繼續向吸水材料方向移動，途經檢測線T區時被2019-nCoV N蛋白重組抗原捕獲，從而令檢測線T顯色，過量未反應的膠體金標記的鼠抗人IgG則繼續向前遷移，途經質控線C區時被羊抗鼠多抗捕獲而使質控線C顯色。
圖1 2019新型冠狀病毒抗體膠體金檢測方法
十、膠體金試劑盒臨床性能評估
以2019-nCoV核酸陽性的確診患者為陽性對照，對照體檢者為陰性對照，確定2019-nCoV IgM和IgG膠體金試劑盒的靈敏度和特異度等指標，判定試劑盒檢測性能是否滿足臨床診斷應用需求。最後使用該試劑盒檢測2019-nCoV核酸陰性的疑似患者的血清IgM和IgG。
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結果一、N蛋白目的基因的擴增
一、N蛋白目的基因的擴增
PCR擴增出的N蛋白基因特異性產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，可見完整清晰的條帶,與預期目的基因大小一致（圖2）。PCR純化產物與pMD19-T simple Vector載體連接後轉化DH5α感受態細胞，獲得重組質粒pMD19-T/N。
圖2 N蛋白基因的聚合酶鏈反應擴增結果
二、重組N蛋白誘導表達鑑定
重組核蛋白陽性克隆菌株（pET-32a/N）轉化原核表達細菌BL21 (DE3)中進行誘導表達，SDS-PAGE電泳結果顯示：經IPTG在20 ℃培養環境中誘導過夜後，在長度約70 kD位置上可見N蛋白的表達。見圖3。
圖3 重組N蛋白陽性克隆菌株的誘導表達結果
三、重組N蛋白的純化與鑑定
經His標籤鎳柱純化系統純化的樣品經SDS-PAGE鑑定，可見pET32a/N表達產物在70 kD處有明顯較單一的重組蛋白表達條帶。純化的重組N蛋白採用陽性血清經蛋白質印跡法鑑定，結果呈現陽性反應，證明表達產物抗原性較好。見圖4。
圖4 pET32a/N表達蛋白純化產物的SDS-PAGE分析和蛋白質印跡法鑑定結果
四、2019-nCoV IgG與IgM膠體金法檢測
採用2019-nCoV IgM和IgG膠體金試劑盒檢測核酸陽性的確診患者和對照體檢者的結果發現，體檢者的血清IgM和IgG檢測均為陰性（圖5A）；2019-nCoV核酸檢測為陽性的確診患者的血清IgM和IgG檢測為陽性（圖5B）。將1例確診患者的血清標本分別按1∶1，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280，1∶2 560的比例稀釋，並設立陰性對照，可見陽性條帶在稀釋到1 280倍時依然可見（圖5C）。
圖5 2019-nCoV IgG與IgM膠體金法檢測試劑盒結果AN1至N5為體檢者血清標本IgG（左）和IgM（右）膠體金檢測結果BP1至P3為2019-nCoV核酸檢測為陽性的確診患者血清標本IgG（左）和IgM（右）膠體金檢測結果C1例確證患者的血清標本稀釋後IgG膠體金檢測結果
五、2019-nCoV膠體金檢測陽性率
對89例2019-nCoV核酸陽性的確診患者、189例2019-nCoV核酸陰性的疑似患者和273例對照體檢者進行進行膠體金檢測，陽性檢出率結果見表1。
表1 2019-nCoV核酸陽性的確診患者、核酸陰性的疑似患者和對照體檢者的膠體金檢測陽性率[例（%）]
六、2019-nCoV膠體金試劑盒臨床效能評估
將2019-nCoV核酸陽性的確診患者設為陽性對照，由於目前反轉錄PCR核酸檢測法的漏檢率較高，核酸陰性的疑似患者不適於設為陰性對照，故選用2019-nCoV感染流行之前（2015年至2018年）的體檢者設為陰性對照。通過檢測和計算發現，2019-nCoV IgM檢測試劑的靈敏度和特異度分別為78.7%和98.2%，2019-nCoV IgG檢測試劑的靈敏度和特異度分別為73.0%和99.3%，聯合IgM和IgG檢測的靈敏度和特異度分別為87.6%和98.2%。
七、2019-nCoV核酸陰性的疑似患者膠體金IgM和IgG陽性檢出率
採用膠體金試劑盒對189例2019-nCoV核酸陰性的疑似患者血清標本進行鑑定分析，發現疑似患者的2019-nCoV IgM和IgG陽性檢出率分別為59.8%（113/189）和52.9%（100/189），IgM和IgG聯合檢測陽性檢出率為66.1%（125/189）。可見2019-nCoV核酸陰性的疑似患者中，有66.1%的患者有可能感染了2019-nCoV。
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討論
2019-nCoV具有很強的傳染性，多數患者感染後出現臨床症狀，但也有部分患者為無症狀感染者，也可能成為傳染源，這給疫情防控和臨床診斷帶來巨大挑戰[5]。當前，批准的多種核酸檢測產品雖然解決了大量存量患者確診的難題，但受限於取樣、檢測試劑和檢測人員等影響，核酸檢測存在檢出率較低，耗時長等不足之處，不適於大規模篩查以發現潛在的陽性感染者。WHO對2019-nCoV實驗室檢查指出，在無法使用核酸檢測時建議使用血清學進行診斷[6]。在既往嚴重急性呼吸症候群（severe acute respiratory syndrome, SARS）、H7N9型禽流感以及寨卡病毒流行期間，均以免疫學技術作為疾病診斷的補充手段[7,8,9]。
本研究採用的2019-nCoV IgM和IgG快速檢測試劑盒，通過膠體金免疫層析技術來檢測患者靜脈血，安全性和便捷性高於咽拭子採樣，大大降低醫護人員被感染和病毒傳播風險，而且不需要任何設備，15 min以內就可以獲得檢測結果。然而，膠體金法也存在不足之處，比如靈敏度低、易受到幹擾。冠狀病毒的N蛋白非常保守，具有很強的抗原性，而且在病毒感染過程中過度表達，因此極有可能誘導機體產生大量針對N蛋白的抗體。本研究同步採用原核和真核表達系統進行2019-nCoV多種病毒蛋白表達，並針對多種蛋白特異多肽片段進行融合表達，以多種蛋白進行優化組合，篩選出特異度高的蛋白或組合，為開發出靈敏度高、特異度強的膠體金試劑盒提供了保障。
本研究通過對2019-nCoV核酸陽性確診患者的血清樣本檢測發現，2019-nCoV的IgM與IgG檢測陽性率均大於70%。考慮到IgM可能在病毒感染後的1周出現，而IgG可能在感染後的2周出現[10]，在流行病學史不詳的情況下檢測2019-nCoV時，建議同時檢測IgM和IgG，檢測陽性率可高達87.6%。值得注意的是，在咽拭子核酸檢測呈陰性的疑似患者中，聯合IgM和IgG檢測的陽性檢出率為66.1%，另外，本課題組對2例咽拭子核酸檢測陰性但肺泡灌洗液核酸檢測為陽性的患者使用本膠體金試劑盒檢測發現，可檢測到IgM和IgG陽性（數據尚未發表）。可見，對於咽拭子核酸檢測為陰性的疑似患者，檢測血清中抗體是對疾病診斷的重要補充手段。除此之外，檢測試劑盒的特異度也是備受關注的問題。據文獻報導，健康獻血人員中冠狀病毒229E和OC43的陽性率分別為98%和100%[11]。本研究中273名對照體檢者的血清樣本的抗體檢測陽性率低於2%，且與HBV、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒感染者的血清並沒有交叉反應，表明本研究的試劑盒檢測的抗體與常見的冠狀病毒不存在交叉反應，但後續仍需進一步驗證試劑盒檢測的抗體與其他冠狀病毒，包括嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV）是否有交叉反應。最新研究發現，2019-nCoV感染患者的唾液核酸檢測陽性率高達92%，通過病毒培養在唾液中可檢測到活病毒[12]。由此可見，唾液是一種頗具潛力的無創檢測標本，可用於2019-nCoV感染者的診斷和病情監測。本研究開發的試劑盒目前可用於檢測血清、血漿以及全血標本中的病毒抗體，後期將會拓展到唾液、尿液等標本的檢測，具有更廣泛的適用性。
綜上所述，本研究設計的2019-nCoV抗體檢測試劑盒（膠體金法）具有快速、便捷，以及靈敏度和特異度高等優點，可彌補核酸檢測條件要求高、耗時長、陽性率較低的不足之處，可作為疾病診斷的重要補充檢測手段，且適合於人群快速篩查，有利於感染防控。為了縮短檢測窗口期，提高陽性檢出率，在後續的臨床實踐研究中，可進一步採用核酸、抗原和抗體多種檢測方式，以及聯合咽拭子、唾液、糞便和血液等多種樣本進行檢測診斷，這對於2019-nCoV感染的診斷和防控具有重要的意義。
利益衝突所有作者均聲明不存在利益衝突
（參考文獻略）
編輯：笪文武 審校：方 琪
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