【背景介紹】
單細胞研究對於理解決定細胞命運和功能的生物學過程和分子基礎至關重要。而且，它可能以高效率和患者特異性增強基於細胞的療法的革新，這是打破當前療法中瓶頸的不可抗拒的必要。在過去的十年中，關鍵技術的蓬勃興起，例如微流控「晶片實驗室」平臺和原子力顯微鏡（AFM）已將單細胞研究從最初的細胞概況「快照」發展為最新的動態單活細胞操作，從而進一步促進了它們的多樣化應用在生物技術領域。其中，納米移液器技術是一種很有前途的單細胞研究策略，它提供了一種具有高空間解析度的有效原位單細胞操作平臺，該平臺將保留細胞微環境，而不是常規細胞裂解。納米移液管的內腔為貨物裝載提供了狹窄的空間。在單細胞操作過程中，納米移液器會在循環和跨膜過程中物理穿孔目標細胞並「消除」複雜生理環境的不利影響，從而擴大了其生物學用途，成為具有單分子精度的多功能工具。
【科研摘要】
作為低分納米移液管方法基於單細胞和原位細胞的操作為闡明細胞內過程提供了可能，並可能有助於提高治療效率和精度。2020年11月，華東理工大學張雋佶/田禾院士團隊在《Angewandte Chemie International Edition》上發表了題為Highpreservation Singlecell Operation through a Photoresponsive HydrogelNanopipette System的論文。他們提出一種光響應水凝膠-納米移液器混合系統，可以實現具有高空間/時間解析度和可忽略的細胞損傷的單細胞操作。該策略克服了納米移液器單細胞研究中的長期障礙，因為在操作過程中始終使用高電勢（~1000 mV）或有機溶劑，這勢必會對目標細胞造成幹擾和損害。光觸發系統可促進無電勢，非侵入性單細胞注射，從而獲得良好保留的細胞生存力（90％存活率）。此外，光碟機動注射可以實現精確劑量可控的單細胞藥物輸送。作為概念驗證，在相應的細胞系中證明了阿黴素的致死劑量大大降低（163-217 fg /細胞），這表明基於光響應水凝膠-納米吸管系統的潛在精密細胞治療策略。
【圖文解析】
作者在這裡報告通過成功地規避細胞損傷問題的無電勢納米移液器系統的突破，在高保存度的單細胞操作中取得了突破。為了實現這一目標，將設計簡單，對光有反應的水凝膠集成到納米移液器中，以提供水凝膠-納米移液器混合系統（圖1）。在可見光（φ> 600 nm）照射下，會發生快速的凝膠-溶膠轉變，並在不施加電勢或使用有機溶劑的情況下驅動穿孔細胞的注入。因此，細胞存活率顯著提高（90％的存活率）。值得注意的是，該策略允許高精度，劑量可控的單細胞藥物遞送，而目前這對於先進方法是難以捉摸的。因此，單個細胞內經典癌症藥物阿黴素（Dox）的時間依賴性注射（7.94 fL/s）和劑量定量（0-326 fg）已在不同細胞系中成功進行。
圖1.a）由紫外線（365 nm）和可見光（φ> 600 nm）引發的二噻吩乙烯（DTE）的光異構化和DTE-L-苯丙氨酸（LPF）水凝膠的光穩定化/去穩定化。b）通過水凝膠-納米吸管系統進行光觸發細胞注射的示意圖。c）注射量隨記錄時間而變化。
為了進行有效的光控注射，水凝膠快速而獨特的凝膠-溶膠轉化是前提條件。作者設計並通過光致變色二噻吩乙烯（DTEc）和L-苯丙氨酸（LPF）的封閉異構體之間的1：1配比合成了一種簡單的光可切換水凝膠。DTE是眾所周知的光致變色材料家族，在紫外線/可見光照射下會發生快速且可逆的光異構化（圖1a）。在存在DTEc的情況下，通過經典的加熱-冷卻膠凝過程形成了穩定的綠色水凝膠，該凝膠可以存儲兩個月以上，而在黑暗中不會降解。相反，用可見光（> 600 nm）照射穩定的DTEc-LPF水凝膠會產生準穩定的淺黃色DTEo-LPF，它在不到1分鐘的時間內解離（圖1a，圖2a），表明凝膠劇烈可見光激發後發生溶膠轉變。通過流變學測量檢查了DTEc-LPF水凝膠的光誘導機械性能（圖2a），證明了凝膠-溶膠轉變的光控特徵。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像（圖2b，插圖）還提供了DTEc和LPF凝膠化的證據，因為觀察到了高度交聯的基質。
圖2.a）流變學分析顯示，可見光（l> 600 nm）照射下DTEc-LPF水凝膠（4 mL）隨時間變化的硬度變化。b）DTEc-LPF水凝膠（綠色實線，3.0 mg/mL），DTEo（深色實線，4.0×10-5 M）和DTEc（深色虛線，4.0×10-5 M）在紫外光下的吸收 在甲醇中照射紫外線（= 365 nm）和可見光（>600 nm）。c）從頭算起DTEc-LPF的包裝結構。
然後研究了這種水凝膠-納米移液器系統隨時間的注入和光觸發釋放過程的實時控制。注射的定量計算可以通過數學模型確定。通過錐形模型進行的分析揭示了在最初的250 s內進樣量與時間之間的線性關係（圖3a），其恆定流量Q = 7.94 fL/s。這種線性關係有助於在負載的水凝膠光解離後精確控制劑量。之後流量開始減慢。此外，還可以通過光刺激實時調節貨物的運送過程。間隔5 s，10 s和20 s的其他光照射脈衝導致流出速率以不同程度急劇增加（圖3c），表明光觸發了通過納米移液管的遞送加速。1分鐘後，所有增強的流出量逐漸恢復到初始速率（圖3b）。
圖3. a）輻射（> 600 nm，2分鐘）後的前250 s中基於納米吸管的注射流速的擬合曲線。b）增加體積的斜率（％）除以時間（s）和可見光的附加照射時間（> 600 nm）。c）額外照射5秒鐘可見光後，隨著時間（s）體積變化（％）增加。
在下一步中，進行了光觸發的具有實時性和劑量可控精度的單細胞藥物釋放。由於巨噬細胞和A549在腫瘤轉移中的重要性42和在基於細胞的療法中的代表性43,44，因此將它們選為靶細胞。首先檢查了光控制策略的高度保留。在可見光的照射下對含水凝膠的納米移液器（無Dox）進行預處理會引起流動，然後在開始運送貨物時將納米移液器打入選定的單元中。令人高興的是，在大氣環境下40分鐘後，甚至進行了480 fL的注射（1分鐘），超過90％的注射細胞仍保持了活力（吞噬作用活躍）（圖4a和4c，視頻2）。與巨噬細胞相比，另一種選擇的細胞系A549細胞表現出更高的生存能力。注入的細胞在大氣條件下經過480 fL的純水凝膠注入4 h後仍保持活力（參見視頻3）。以上結果證明了該光控納米移液器注射策略的高度保留以及負載的水凝膠的低細胞毒性的堅實證據。
圖4. a）注射純水凝膠（60 s，480 fL）後沿時間的細胞活力b）注射不同量的載有藥物的水凝膠後，細胞隨時間的活力。c）注射120 fL載藥的水凝膠（橙色）和480 fL純水凝膠（黃色）後的細胞活力。
參考文獻：doi.org/10.1002/anie.202013011
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