原創 王萌冉 SIFIC感染官微 來自專輯全球抗疫，SIFIC在行動！
新冠病毒疫情在全球多國暴發，防控形勢各有不同，應對策略也千差萬別，而國內「外防輸入，內防反彈」的策略始終不能放鬆，復工復產復醫的緊迫形勢又給疫情防控提出了更大挑戰。SIFIC作為中國最大的感控-感染學術團體，發揮所長，全新打造了一個國內國際專家抗疫經驗分享交流的平臺，為世界公共衛生安全貢獻力量。
「全球抗疫，SIFIC在行動」直播專欄為大家推出第二季，新平臺，新形式，新體驗，每周一期，我們將繼續邀請國內/國際知名專家在線分享、交流與互動，緊扣抗疫熱點問題，與您探討策略最新變化。
2020年，新冠病毒疾風漫捲，在全球200多個國家和地區暴發。從疫情伊始各國對新冠病毒的漠視到隨著確診病例的攀升以及死亡人數的增加不得不高度重視。我國疫情防控到目前為止已經取得階段性勝利，但國際防控形勢依然不容樂觀，縮減國際航班畢竟不是長久之計，如何在國際航班開放和秋冬季到來的情況下，避免疫情的反撲已成為重點關注話題。
專家公認要徹底消滅新冠病毒，結束這場全球大流行，研製和生產疫苗是唯一的辦法，新冠疫苗的研究成為全民關注的熱點話題。
周六（5月30日）19-21時，SIFIC有幸邀請到了王貴強教授、胡必傑教授、黃卓英所長、凌雲教授、王萌冉博士共同探討「新冠疫苗能否成為疫情終結者」，現在，讓我們一起來回顧下專家們的觀點吧。
講者：王萌冉（復旦大學附屬中山醫院感染病科 主治醫師）
整理：朱越燕（浙江省人民醫院）
審核：王玉蘭
來源：SIFIC全球抗疫 我們在行動
2020年，新冠病毒疾風漫捲，終結這場新冠全球大流行，研製和生產疫苗是唯一的辦法，新冠疫苗的研究成為萬眾矚目和全球關注的熱點話題，目前仍有較多的疫苗處於早期的動物實驗階段以及一期、二期的臨床研究階段，許多結果尚未發表，王萌冉博士選取了重組腺病毒5型載體COVID-19疫苗的I期試驗結果與大家分享。
三篇主要參考文獻
第一篇是陳薇院士於5月22日在線發表於《柳葉刀》雜誌上的關於腺病毒5型載體疫苗的一起臨床實驗結果。
第二篇及第三篇文獻是近期發表於《新英格蘭》雜誌以及《免疫學》雜誌中關於新冠疫苗近期研究現狀的觀點以及報告。
新冠病毒的結構
新冠病毒的相關結構如圖所示，構成這個病毒的主要蛋白包括S蛋白，M蛋白、N蛋白，以及血凝素蛋白還有外膜蛋白等等。其中較為主要的S蛋白可以通過位於S1亞基上的受體結合區與特異性受體結合導致病毒感染細胞。針對S蛋白的抗體可以有效阻斷這一過程，從而防止病毒侵入。此外S蛋白還可以有效地刺激T細胞免疫應答，因此是疫苗設計最重要的一個靶抗原。
新冠病毒疫苗的研究
1、疫苗的開發時間漫長，投入大，風險高
疫苗的開發漫長而昂貴。由於成本及高失敗率，在傳統模式下，開發人員遵循線性的步驟序列，隨時可能出現停滯不前。而在大流行的模式下，可以通過步驟之間的重疊縮短研發時間，但是此模式可能導致財務風險增加。
2、目前全球範圍內最主要疫苗有6種
表2 不同種類的疫苗具有不同的特點
6種疫苗包括：RNA疫苗、DNA疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、減毒活疫苗，以及滅活病毒疫苗等，其中前4種主要針對新冠病毒的S蛋白。
不同種類疫苗具有不同的特點：
DNA疫苗和RNA疫苗屬於核酸疫苗，研發周期短，但免疫原性相對較弱，不易產生黏膜免疫應答。
重組蛋白疫苗，如B肝疫苗、HPV疫苗等，安全性較高，免疫源性較強，能誘導黏膜免疫反應，但不能有效產生細胞毒性T細胞。
病毒載體疫苗，如伊波拉病毒疫苗，免疫原性強，基因傳遞的效率高，但是它可能存在載體本身的免疫反應問題。
減毒活疫苗，如麻疹疫苗、乙腦疫苗等具有較好的免疫原性，獲得免疫力較為持久，但是部分病毒，如SARS的減毒活疫苗可能存在連續傳代以後，會恢復部分毒力。
滅活病毒疫苗，如流感疫苗、手足口病疫苗為最經典的疫苗形式，容易製備，高效引起體液免疫應答，但誘導反應較弱，保護效力不滿意。
3、WHO組織目前公布的最新候選疫苗：
截止到2020年5月22日，有10支候選疫苗已進入臨床試驗評估階段，其中4支疫苗來自中國，見下表。目前陳薇院士團隊的腺病毒載體疫苗，以及美國摩得納生物科技公司研發的一個mRNA疫苗都已經進入到了二期臨床階段。還有114支候選疫苗正在進行臨床前的評估。
4、腺病毒載體疫苗一期臨床試驗：
2020年3月17號，腺病毒載體疫苗進入一期臨床試驗階段，108名年齡在18~60歲之間的志願者納入研究。
（1）納入標準：核酸檢測及抗體檢測陰性，胸部CT檢查無病灶。
（2）未納入者：有發熱以及精神疾病史；對疫苗任何成分過敏；過去4個月內接受過任何其他的血製品輸注；服用過其他研究藥物或者是接種過任何疫苗；無法服從此項實驗的，排除出此項研究。
（3）按照入選順序，以劑量遞增的一個方式入組，在每組接種後有三天的安全觀察期。
5、實驗方法：
（1）疫苗採用基因工程方法製成，以複製缺陷型人5型腺病毒為載體，將新冠病毒的S抗原基因重組到腺病毒基因組中，製成每0.5毫升含有5×10^10個的病毒顆粒的液體製劑，採用肌肉注射的方式。
（2）低劑量組單側手臂注射一劑；中劑量組單側手臂注射兩劑，高劑量組一側手臂注射兩劑，另一側手臂注射一劑。
在試驗過程中受試者自行報告記錄不良事件，第7天進行實驗室檢測，包括白細胞、淋巴細胞、血小板、轉氨酶、膽紅素、肌酐等指標；用藥物不良反應量表，對所有不良事件及實驗室檢查異常變化進行分析。
（3）在接種疫苗的之前、接種疫苗後第14天和第28天，從受試者中抽取血樣進行血清學檢查，同時分離得到外周血的單個核細胞，測定結合抗體、中和抗體、γ幹擾素，從而評估新鮮外周血單個核細胞的特異性T細胞反應；測定γ幹擾素、白介素2、腫瘤壞死因子α，評估CD4+和CD8+T細胞對疫苗的反應。
（4）在試驗的第28天，為了排除試驗期間新冠病毒對所有受試者可能的影響，所有受試者均接受特殊的IgG、IgM的血清冠狀病毒核衣殼蛋白抗體檢測，結果顯示108名受試者均呈陰性。
6、試驗主要終點：包括安全性終點、體液免疫終點、細胞免疫終點。
安全性終點主要指7天內出現不良反應為主要終點；疫苗接種後7天實驗室檢測的任何異常變化以及28天內的不良反應都是次要的安全性終點。
體液免疫終點是指結合抗體及中和抗體產生的量，把陽性抗體反應定義為在疫苗接種後滴度比基線水平至少增加了4倍。細胞免疫終點比較各組細胞內測定的ELISpotγ幹擾素和陽性T細胞反應作為細胞免疫的終點。此外，根據基線測定的腺病毒綜合抗體的滴度，對所有受試者的免疫反應進行了分層分析，包括陰性以及低滴度組，定義為小於1:200，大於1:200定義為高滴度組。
7、試驗研究結果（如下圖）
（1）受試者按照入選順序分別進入三個劑量組，這三個組的組員年齡、性別、合併基礎疾病，及腺病毒的中和抗體滴度等，在三組間沒有明顯的組間差異。
（2）三組組員接受注射後所產生的不良反應：
不良反應的發生率比較接近，高劑量組發生不良反應的人數最低，但是發生三級及以上不良反應的發生率明顯升高，注射部位不良反應主要包括疼痛，紅腫，硬結、瘙癢；全身的不良反應主要包括發熱、乏力、頭痛、關節肌肉疼痛、食慾減退、腹瀉等。
（3）不良反應發生時間：三組內28天與7天內的不良反應發生率沒有明顯的差別，提示接受該疫苗注射後的不良反應發生在注射後7天內。
（4）抗體產生情況：第14天和第28天檢測中，觀察快速結合抗體的反應，第28天高劑量組的結合抗體平均滴度高達1445.8，中劑量組為806，低劑量組為615.8，具有明顯的組間差異，受試者在第28天結合抗體滴度上升超過4倍。
抗新冠病毒的中和抗體，在第0天陰性，第14天中度增加，第28天達到高峰，高劑量組的中和抗體滴度明顯是高於中劑量組以及低劑量組，高劑量組中有75%的受試者抗體滴度增加4倍。
分層分析顯示，高腺病毒中和抗體滴度會影響中和抗體在疫苗接種後的一個血清轉化率。
8、γ幹擾素的一個特異性T細胞結果
（1）利用ELISpot法測定γ幹擾素的特異性T細胞結果（見下圖）。其中陽性應答反應定義為在注射疫苗後分泌γ幹擾素的特異性T細胞數量至少增加了兩倍，所有受試者在接受疫苗注射前均未檢出特異性的T細胞，在接種疫苗後第14天達到了高峰，低劑量組為20.8，中劑量水為40.8，高劑量為58。
（2）高劑量組T細胞反應明顯高於低劑量組以及中劑量組，陽性應答者在各劑量組中的比例為83%~97%。第28天，各劑量組的T細胞反應均較前有所下降。
（3）分層分析顯示抗腺病毒中和抗體高滴度組中，所有劑量組的T細胞反應均有不同程度的降低，尤其是對於低劑量組及中劑量組的影響更加明顯。第14天高劑量組有94%的受試者，以及第28天高劑量有100%的受試者均出現了陽性的應答反應。
（4）在接種疫苗後的第14天和第28天，所有劑量組的CD4+和CD8+的T細胞中，均可以檢測到γ幹擾素，腫瘤壞死因子α、以及白介素2的表達明顯都是升高的，其中第14天，三個劑量組之間腫瘤壞死因子α的表達具有明顯的組間差異。
（5）低劑量組的CD4+T細胞和CD8+的T細胞的表達明顯低於中劑量組和高劑量組的。此外，CD4+T細胞白介素表達明顯高於CD8+T細胞。
9、CD4+T細胞和CD8+T細胞產生IFNγ、TNGα和IL－２組合比例
（１）CD4+T細胞和CD8+T細胞產生γ幹擾素、腫瘤壞死因子α、白介素2不同組合的一個比例（見下圖）。對於CD4+T細胞的多功能的表型比例明顯比CD8+T細胞的比例要高，並且隨著疫苗的劑量的增大，多功能的表型比例也是逐漸升高的。
10、試驗結果得出的結論：
（１）腺病毒的載體疫苗最常見的不良反應是發熱、疲勞、頭痛以及肌肉酸痛等，但是各組間的不良反應的發生率沒有明顯差異。提示腺病毒5型載體疫苗的安全性以及耐受性，目前在健康成人中是可以接受的。
（２）該疫苗具有較好的免疫原性。
（３）陳薇院士團隊主要討論如下問題：
後續劑量選擇的問題，雖然高劑量組的細胞免疫以及體液免疫的反應性更好，但是相對來說發生嚴重不良反應，三級及以上的發熱疲勞，肌肉酸痛等的比例也相對比較高，這些不良反應與以往文獻報導，以腺病毒作為載體的伊波拉病毒等都是類似的，因此猜測可能會與腺病毒作為載體本身感染引起的病毒血症有關，後續會選擇低劑量組，以及中劑量組進入二期臨床試驗評估。
抗腺病毒中和抗體的高滴度會減弱疫苗誘導的免疫反應，尤其低劑量組，在第28天結合抗體的滴度增加4倍的比例只有20%，而特異性T細胞陽性應答的比例也只有60%。
根據以往文獻，對SARS及MERS的研究表明，特異性抗體結合抗體是暫時的，在患者康復以後會快速的下降，而本次一期臨床試驗僅僅研究了前28天的結果，因此還需要在後續較長時間內持續隨訪免疫應答情況。
目前疫苗所產生的一個免疫應答是否具有實際的保護作用尚不明確，不過在前期的動物實驗中，接受該疫苗注射的8隻雪貂中，有7隻在鼻腔滴注新冠病毒後沒有從血中檢測到核酸，說明疫苗可能具有一定保護性作用。
本次一期臨床實驗隊列規模比較小，缺乏隨機對照，所選取的受試者年齡均在60歲以下，但是很多研究都表明，年齡是新冠病毒感染的獨立危險因素，機體的免疫應答會隨著年齡的增長而不同程度下降，因此對60歲以上的人群仍需要進一步的研究。
專家對話
問題：新冠疫情在全球暴發，嚴重影響人類的生活，全民對新冠疫苗的研發有更多期待，希望成為疫情的終結者，目前國內外新冠疫苗研發進展如何？
王貴強教授：新冠疫情形勢嚴峻，人們期盼疫苗早點問世。針對傳染性疾病，疫苗是最有效的，也是人類抗擊新冠疫情的希望，但疫苗研發還存在許多問題，我們要客觀對待。我參加過疫苗的多次討論，對疫苗研發進展情況有所了解，談幾點想法：
疫苗研發存在許多不確定性，如SARS疫苗研發出來，但沒有了病例，MERS病例較少。因此，新冠疫苗沒有經驗可借鑑，疫苗研發的成功率不高，且存在變異，有的疫苗每年需要更新，如流感疫苗。
疫苗能不能產生持久免疫力？研究顯示，一個多月後綜合抗體在下降，以後的保護力是否持續是問題。（國外疫苗研究獲得的信息：綜合抗體6個月大幅度下降。有沒有持久保護力值得研究。中國已有一些研究數據，動態的監測抗體是否下降。其他免疫活性如何，還有繼續研究中，有還有變異問題需要觀察。目前研究疫苗多數針對S靶點，如果出現變異怎麼辦？）
安全性問題：從已做的I期臨床實驗研究看，安全性是比較好的。SARS疫苗曾出現病情加重問題，現在也擔心新冠疫苗出現病情加重。安全性影響和制約疫苗的上市時間。
難度最大的是三期臨床試驗：陳薇院士團隊做了一期臨床試驗，證明安全性、有效期。抗體保護效能要看三期臨床試驗，即人體實驗，也稱攻毒試驗，選擇一些志願者，年齡在18-60歲，英國等對此爭論不休。我國的最大問題是在哪裡做三期？三期要在高流行區做，需要上萬份標本，且周期長，在中國已不可能做。
疫苗產能問題：如果疫苗研發成功後，大批量的疫苗在哪裡生產？生產疫苗要求在P3實驗工廠進行，對此還沒有標準可參考，如何保證生物安全？
現階段疫苗研發很重要，但遠水解不了近渴。目前疫情防控仍很重要，通風、戴口罩、手衛生、保持社交距離等仍然是有效的防控措施。
藥物研發，如抗病毒藥物研發。對降低病死率問題，抗病毒重要，但支持療法、氧療等也很重要，我國已有成功的經驗。
抗體藥物：綜合抗體是靠譜的，早期使用有效，屬於被動免疫。
新冠疫苗大家一直在期待，疫苗上市不容易。目前做好防控，早發現早治療，支持治療、氧療不可少。
感悟
王萌冉博士詳細介紹了重組腺病毒5型載體COVID-19疫苗的I期試驗過程、方法、實驗結果、研究結論，讓我們對目前新冠疫苗研究進展有了一個全面了解，也給大家普及疫苗研究的相關知識，開拓了眼界，增長了知識，受益良多。
王貴強教授對國內外疫苗研發情況的詳細解讀更是錦上添花，從國家層面介紹新冠疫苗國內外研究進展，面臨的問題及解決的思路。
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