專題筆談│病毒誘導氣道黏液高分泌機制
張惠琴，孫 新
中國實用兒科雜誌 2018 Vol.33（3）：179-183
氣道黏液高分泌是慢性呼吸系統疾病重要特徵。病毒感染是氣道黏液高分泌的常見誘發因素。認識病毒感染與氣道黏液高分泌的關係及機制，對防止和減輕氣道黏液高分泌，降低慢性呼吸系統疾病的病死率有重要意義。黏蛋白（mucin，MUC）MUC5AC表達增加是氣道黏液高分泌的主要病理基礎，針對常見呼吸道病毒感染引起的氣道黏蛋白MUC5AC分泌的信號傳導通路進行討論很有必要。
氣道黏液高分泌；黏蛋白5AC；病毒；信號通路
作者單位: 第四軍醫大學西京醫院兒科, 陝西 西安 710032
通訊作者：孫新，電子信箱: sunxin6@ fmmu.edu.cn
病毒是兒童呼吸道感染常見病原，是慢性氣道疾病發生、發展或反覆加重的重要因素。其主要病理改變為炎性細胞浸潤、黏膜充血水腫、上皮細胞壞死脫落、黏液分泌增加等。氣道黏液分泌過多會阻塞氣管腔，引起並加重支氣管和肺部感染，導致肺功能不可逆下降，甚至引起呼吸衰竭和死亡［1］。近年來的研究證實，氣道黏液高分泌是多種慢性氣道炎症性疾病的主要病理生理特徵，是影響多種慢性氣道炎症性疾病的發病與臨床進展、預後的重要危險因素［2-4］。目前氣道黏液高分泌已成為慢性氣道炎症性疾病的研究熱點及治療目標。因此，深入探討病毒感染與氣道黏液高分泌的關係及發病機制，對慢性氣道疾病防治有重要理論價值和臨床意義。
1 氣道黏液高分泌
正常氣道黏膜表面覆蓋少量黏液，具有保護氣道、潤滑上皮、防禦外來刺激物和阻止細菌定植等作用。氣道黏液由黏膜下黏液腺、杯狀細胞及氣道上皮細胞分泌，包括水、糖、蛋白質、脂質及礦物質，其中黏蛋白（mucin，MUC）是氣道黏液大分子的主要組成部分， 由MUC基因編碼的至少包含1個連接寡糖並富含絲氨酸和蘇氨酸的糖蛋白構成［5］。黏液合成受MUC基因調控， 已鑑定出21種不同的黏蛋白基因， 在呼吸道中表達的至少有12種MUC基因， 其中MUC5AC和MUC5B分別是支氣管上皮和黏膜下腺細胞產生的主要呼吸道黏蛋白［6-7］， 而MUC5AC是在病理情況下氣道黏蛋白的主要增加類型［6，8］。故氣道上皮中MUC5AC的轉錄水平和蛋白含量可代表氣道黏液分泌的強度［9］。
在呼吸道上皮細胞中，MUC5AC基因受到包括吸菸、病毒感染、氧化應激及空氣汙染物等各種刺激物的誘發，可產生大量促分泌因子及炎症介質［白介素（IL）-13、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-9等］，直接或間接作用於杯狀細胞和黏膜下腺細胞引起氣道黏液過度分泌［2］。
2 病毒感染與黏液高分泌的關係
呼吸道黏液的產生是由許多呼吸道病毒感染引起的，包括鼻病毒（rhinovirus，RV）、流感病毒（influenza virus，IV）和呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）等［10-11］。黏液的產生有利於清除病毒，然而，黏蛋白過度分泌可能導致氣道阻塞，並加劇原有的呼吸道疾病，使先天清潔防禦系統變成有害的機制［6，12］。
氣道上皮細胞可通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）快速識別病原體相關分子模式［13］。大多數常見的呼吸道病毒感染是由RNA病毒引起的。一些呼吸道DNA病毒（如腺病毒）在細胞內的生命周期內可產生RNA分子。在氣道上皮細胞中有幾種病毒RNA「傳感器」，包括Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）和細胞內病毒傳感器如蛋白催化酶（protein kinase double-stranded RNA，PKR）、維甲酸誘導基因Ⅰ（retinoic acid inducible-geneⅠ，RIG-Ⅰ）、黑素瘤分化相關基因5（melanoma differentiation associated gene 5，MDA5）。在哺乳動物中，目前已經確定了13個TLR家族成員。TLR3可識別許多呼吸道病毒，包括RV［14］、RSV［15］和IV［16］。 通過細胞內病毒傳感器也可識別病毒，在呼吸道上皮細胞中，MDA5已經被證明能夠識別像RV這樣的小RNA病毒，RIG-I也被證明能識別IV和RSV［17］。這幾種不同的「傳感器」可導致不同的下遊信號通路和效應器，雙鏈（double-stranded，ds）RNA是許多病毒（包括RV）感染上呼吸道的生物活性成分。如RVdsRNA可被PKR識別來誘導IFN依賴的抗病毒防禦基因被激活並有助於細胞內病毒的清除；而被TLR3識別可誘導黏蛋白MUC5AC的產生［18］。
雖然病毒被識別後在氣道中可以產生數十種黏蛋白誘導性細胞因子和其他炎性因子［6，12］，但是在體內產生的量是否足以驅動黏蛋白表達，在很大程度上是未知的。最近，有研究表明［19］，病毒感染可以在沒有炎症介質的情況下直接激活氣管上皮細胞中的黏蛋白表達。
不同病毒及同一病毒不同病毒株對氣道黏液分泌的影響並不一致，機制也不盡相同。儘管學者們對病毒感染導致的黏蛋白合成的信號級聯反應及相關通路做了一些研究，但至今對黏蛋白過度表達的機制仍不十分明確。
3 病毒感染與氣道黏液高分泌的機制研究
MUC5AC啟動子位於兩個不同位點：活化蛋白-1（activation protein-1，AP-1）結合位點和核因子-κB （nuclear factor of kappa B，NF-κB）結合位點［20-21］。NF-κB是激活MUC5AC表達的轉錄因子，在靜息的細胞中，NF-κB 和NF-κB的抑制蛋白（inhibitor kappa B，IκB）形成複合體，以無活性形式存在於胞漿中。當細胞受細胞外信號刺激後，IκB激酶複合體（IκB kinase，IKK）活化將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點，游離的NF-κB迅速移位到細胞核，與特異性κB 序列結合，誘導MUC5AC基因轉錄［22-23］。AP-1是 MUC5AC的另一轉錄激活因子，由C-Jun和c-Fos蛋白的同源或異源二聚體組成。以往研究表明，AP-1主要被絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成員激活，如細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和c-Jun N末端激酶（C-jun N terminal kinase，JNK），隨後增強下遊轉錄因子包括Elk-1，c-Jun，ATF2和CREB，其又調節c-Fos和c-Jun的表達，從而啟動MUC5AC的轉錄［23-24］。
當呼吸道病毒感染氣道上皮細胞時，會引發一系列信號傳導途徑，使信號進入細胞並向細胞核發出信號以產生黏蛋白。以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）級聯反應為例，簡要描述級聯反應的主要元素［25］：（1）初始信號：呼吸道病毒沉積在氣道上皮細胞後，病毒相關分子模式被模式識別受體識別。（2）活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 的生成：氣道上皮細胞表達雙氧氧化酶1（dual oxidase 1，DUOX1），並通過活化還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶生成ROS。（3）腫瘤壞死因子α轉化酶（tumor necrosis factor a converting enzyme，TACE）和其他金屬蛋白酶裂解EGFR配體。TACE是跨膜金屬蛋白酶家族的成員，TACE被ROS激活並裂解膜結合的EGFR配體，並激活EGFR與之結合［26］，隨後使 ERK1/2、p38MAPK和JNK磷酸化，導致AP-1和NF-κB活化，進而導致MUC5AC分泌增加［23］。
3.1 RSV導致氣道黏液高分泌的機制 RSV是兒童最常見的病毒性呼吸道疾病住院原因［27］，據報導，每年約有5％的兒童死於RSV感染引起的重症肺炎［28］。有研究顯示，50%～70% RSV感染與氣道黏液高分泌有關［29］，且氣道黏液高分泌誘發和加重了RSV感染引起的肺炎［30］。
多項研究證實，RSV感染與MUC5AC表達上調相關［31-32］。如Mata等［32］ 發現，RSVlong株感染肺上皮細胞A549細胞可誘導MUC5AC表達上調，但其表達的具體機制仍不清楚。有研究顯示，RSV感染後出現的氣道黏液高分泌與IL-13水平升高［33-35］及黏附分子TLR-4和ICAM-1［36-37］的表達增加有關。而鮑一笑等［38］發現，呼吸道上皮細胞系NCI-H292細胞在體外感染RSV後MUC5AC啟動子的活性增強，黏蛋白表達增加，且這一變化不依賴細胞表面的TLR-4和ICAM-1，也不依賴IL-13的作用。目前，對於RSV病毒感染誘導的黏蛋白合成所涉及的信號級聯反應和途徑仍然沒有共識。有研究通過細胞模型和臨床病例來驗證JNK/AP-1通路參與了RSV感染引起的氣道黏液高分泌的病理過程［30，39］， 可能的機制為RSV感染後活化了ROS/Src， 隨後活化JNK， 進一步磷酸化轉錄因子c-Jun胺基酸末端的特定位點， 磷酸化後的c-Jun通過誘導同源或異源二聚體形成， 與核內AP-1順式作用元件位點結合啟動MUC5AC基因轉錄［32，39］。也有研究顯示，RSV的融合蛋白（Fusion protein，F）與EGFR相互作用激活了EGFR，並誘導黏蛋白MUC5AC基因的表達［40］，可能的機制為EGFR與其配體結合後，隨後激活各種下遊信號，如ERk1/2、MAPK和P13JNK等相關通路，由此傳導至細胞核，促進MUC5AC基因的轉錄，合成並分泌過多的黏蛋白，導致氣道黏液高分泌［25］。
3.2 RV感染導致氣道黏液高分泌的機制研究 RV感染與2/3的哮喘和1/3的慢性阻塞性肺疾病（COPD ）惡化相關［41-42］，這與其導致氣道黏液過度分泌密不可分［43］。已有研究確定RV感染誘導MUC5AC的合成和分泌的機制及相關信號通路。Hewson等［44］研究發現，RV感染呼吸道上皮細胞引起NF-κB激活和核移位的。隨後導致剪切轉化生長因子（transformation growth factor，TGF） -α的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的轉錄和翻譯，並且活化的TGF-α從細胞表面釋放，活性TGF-α通過旁分泌-自分泌機制結合併激活存在於上皮細胞表面的表皮生長因子受體（EGFR）。 EGFR的細胞內結構域的磷酸化激活細胞信號級聯，包括絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）和ERK激活，並最終導致MUC5AC啟動子的特異性蛋白（Sp） 1反式激活。這促使MUC5AC基因的從頭轉錄，增加MUC5AC mRNA的量，最終導致MUC5AC黏蛋白的分泌。Zhu等［11］研究表明，RV感染後通過TLR3介導的MUC5AC表達部分依賴於TLR3/4銜接蛋白TRIF並受TLR接頭蛋白MYD88的負調節［45］。TLR3通過誘導EGFR配體TGF-α和AREG的表達，並通過旁分泌或自分泌機制激活了EGFR，進而激活了EGFR-ERK信號通路，激活下遊的蛋白激酶，最終導致關鍵的轉錄因子NF-κB和幹擾素調節因子3（interferon regulatory factor，IRF3），從而誘導氣道黏蛋白表達。該文雖沒有描述完整的信號通路，且沒有確定中間體MMP的誘導，但是它們對上遊TLR-3信號的鑑定，增加了開發新的潛在治療靶標的範圍。
不同的黏蛋白由不同信號通路控制。MUC2主要產生部位在結腸， 其次是呼吸道。已經證明， MUC2系通過GPCR-PLC-PKC-P38-NF-κB誘導途徑產生［46］。具體信號通路為當RVdsRNA感染上皮細胞時， dsRNA刺激細胞外釋放ATP和活化細胞表面ATP受體（即ATP受體自分泌激活）， 通過G蛋白偶聯， 進而激活對磷脂酶C（PLC）和蛋白質激酶C（PKC），在一個NF-κB和p38依賴的模式下黏蛋白MUC2基因轉錄， 從而增加了病毒引起的黏液分泌。
3.3 流感病毒感染導致氣道黏液高分泌的機制研究 甲型流感病毒（influenza a virus，IAV）具有不同的病毒株（季節性和大流行）和不同亞型（H3N2、H1N1及H7N9），所有病毒株均能誘導MUC5AC基因表達［47］。Barbier等［47］ 研究表明，IAV感染在體外上皮細胞和小鼠肺中均可導致MUC5AC在轉錄和蛋白質（翻譯）水平上上調。其合成依賴於在IAV感染後涉及TACE和HAT活性的蛋白水解途徑的活化。該蛋白水解途徑導致EGFR的激活活化，然後激活ERK和Sp1。即蛋白酶-EGFR-ERK-Sp1，誘導MUC5AC基因的轉錄和蛋白合成。
4 展望
近年來，很多學者在病毒感染對氣道黏蛋白MUC5AC的表達與分泌方面做了相關研究，取得了一些進展。研究兩者的關係並探索其信號通路和調節機制，對慢性氣道疾病的發生發展機制研究意義重大。對尋找控制黏液高分泌的新的治療方法，指導臨床治療均具有重要意義。氣道黏蛋白基因上調及其下遊信號激活是氣道黏液高分泌的病理基礎，因此，調控黏蛋白基因表達可能會成為未來治療慢性氣道炎症性疾病的新方向。
參考文獻 (略)
（2017-12-01收稿）
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