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編譯：謝勇飛，編輯：謝衣、江舜堯。
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導讀酚酸是一種在日常食物攝取中廣泛分布的植物化學物質，酚酸參與了多種生理活動，例如養分吸收，酶活性，蛋白質合成，光合作用，種子、葉、根和莖的細胞骨架結構，植物酚酸主要通過莽草酸途徑產生，植物中發現的酚酸的兩個主要類別是C6-C1和C6-C3。C6-C1酚酸具有羥基苯甲酸骨架，包括原兒茶酸、沒食子酸、香蘭素酸、龍膽酸和丁香酸。C6–C3酚酸具有羥基肉桂酸骨架，包括咖啡酸、芥子酸、對香豆酸，鄰香豆酸、阿魏酸和異芥酸。自然界中發現的大多數生物活性酚類化合物是複雜的酚酸衍生物，植物中的酚酸以游離、游離的酯以及共軛（結合）形式呈現。由於酚酸具有抗氧化特性致使酚酸具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和血管舒張活性等生物學活性。酚酸是一種次生代謝產物，通常在植物源性食物中可以找到，是我們日常飲食的重要組成部分。蔬菜、水果作為天然食品，營養豐富，對人體健康具有重要意義。礦物質、維生素、抗氧化劑和色素普遍存在於蔬菜中。蔬菜如菠菜、西蘭花和洋蔥富含抗氧化劑，十字花科蔬菜也是天然抗氧化劑的豐富來源，十字花科蔬菜中酚類、生育酚和抗壞血酸含量較高，其中對活性氧損傷具有保護作用。在日本進行的一項研究調查了8種葉菜類蔬菜的酚酸組成和抗氧化能力。然而，中國研究人員很少對傳統蔬菜的酚酸組成進行深入研究。因此，本研究的結果可以增進我們對蔬菜酚酸譜的了解，並對食品營養學家和消費者有益。本文使用HPLC-MS對我國常見的44種蔬菜中的這些酚酸進行了定性和定量分析，並對游離可溶性酚酸和結合不溶性酚酸的分布和濃度進行了測定，測定結果可作為植物食物營養資料庫的補充。
原名：Determination of phenolic acid profiles by HPLC-MS in vegetables commonly consumed in China
譯名：HPLC-MS法測定常見蔬菜的酚酸譜
期刊：FOOD CHEMISTRY
IF：5.399
發表時間：2018年10月13日
通訊作者：陸柏益,劉賢金
通訊作者單位：浙江大學生物系統工程與食品科學學院，江蘇省農業科學院食品質量安全與營養研究所
本文首先通過蔬菜採集地，蔬菜的消費頻率，不同地區，季節蔬菜的生產情況等因素，確定了44種蔬菜，蔬菜樣品隨機從杭州、重慶、廣州、北京、武漢5個城市的大型現代超市和傳統開放市場購買，每種蔬菜至少採集15個樣本，收集了660多份樣品，並將其分為六類：水果、葉、根、花、莖和豆類，採集的同一蔬菜樣品（僅包括可食用部分）均化為混合樣品。冷凍乾燥後，44個混合樣品在-80°C下儲存，分析時，首先使用GB/T 134 5009.3-2010標準對樣品含水量進行檢測，游離酚酸樣品製備：從含有0.2%維生素C的20毫升80%甲醇水溶液中提取樣品2 g樣品，在渦流振蕩10秒後，在室溫下對樣品進行30分鐘的超聲波處理，高速離心，將上清液移入50ml容量瓶中，在重複提取之後，混合上清液。分析之前將上清加水至50 mL並通過0.22μm微孔膜。游離酚酸酯樣品的製備：提取過程同游離酚酸樣品製備至高速離心取上清液，之後將上清液移到100毫升梨形燒瓶中。重複提取後，組合上清液減壓濃縮濃縮至至20毫升，將濃縮液移入150 mL錐形瓶中，並用20 mL 4 M氫氧化鈉水溶液處理，並且氮吹，將混合溶液在40℃下在氣浴中水解2 h，搖動並避光。通過添加4 M鹽酸水溶液，將pH值調整為2。將混合液與20毫升正己烷在室溫下搖動20分鐘，然後去除正己烷層。接著40mL乙酸乙酯提取水層，用旋轉蒸發器在35℃下將混合提取物濃縮至幾乎乾燥，殘渣溶解在10毫升50%甲醇/水中，通過0.22μm微孔膜。結合酚酸分析用樣品的製備：同游離酚酸酯樣品的製備。HPLC–MS 分析：用安捷倫1260系列高效液相色譜儀對酚酸提取物進行了分析，在反向C18柱上進行分離，溫度保持45℃，A相乙腈，B相0.1%水甲酸溶液，以0.25毫升/分鐘的流速泵送，總運行時間為20分鐘，注射量為5μL。濃度梯度如下，0%–5% A持續1分鐘，5%–13%A持續1分鐘，13%–184 15%A持續4分鐘，15%–21%A持續1.5分鐘，21%A持續1分鐘，21%–27%A持續1分鐘，27%–50%A持續2.5分鐘，50%A持續1分鐘，50%–5%A持續1分鐘，5%A持續6分鐘。使用ESI的質譜（QTRAP 6500，AB Sciex, Framingham, USA）同時進行多反應監測，並進行正負離子模式掃描，ESI條件如下：4400和-4400 V之間的離子噴射電壓，溫度：400°C，幕式氮氣:30 psi,碰撞氣體：氮氣，15psi，霧化器氣體：空氣，60psi,和加熱器氣體：空氣，65 psi，使用Analyst 1.5.1版軟體進行數據採集和處理。統計分析：至少15種蔬菜中製備的混合樣品的以三種方法對酚酸水平進行測量，採用SPSS 20.0軟體進行分析。
1.高效液相色譜-質譜法方法的優化與驗證
首先對17種酚酸進行了表徵，以確定其前體離子，並為MRM 選擇產物離子，考慮到全掃描質譜中優勢離子的靈敏度和重現性，我們選擇了17種酚酸的負模式。基於分析的峰面積優化了HPLC-MS 參數以最小化基質效應並提高總靈敏度，參數包括毛細管電壓、去聚集電位、碰撞能和保留時間，優化參數見表1，
蔬菜中含有17種酚酸的標準品和質譜進行了比對，通過測量六種濃度的標準溶液製備每種化合物的校準曲線，在進行HPLC-MS分析之前，通過在樣品中加入極低濃度的分析物來確定分析方法的限值，計算了檢測限，結果顯示，校正曲線在0.005-50.0mg/L濃度範圍內呈線性趨勢，相關係數良好（R2>0.990）。LOD值在0.008-0.042mg/L範圍內，日內和日間相對標準偏差分別低於6.4%和6.2%。現行方法的靈敏度明顯高於以往報導的方法。高效液相色譜質譜法也能比以前報導的方法檢測更多的蔬菜中的酚酸，將蔬菜樣品（2.0g）分別加入1.0和5.0mg/L 的酚類標準品，測定回收率。提取加標樣品，然後用改進的方法進行分析。每個實驗在每個級別重複6次，濃度水平和詳細結果見表2。回收率在71.0%-110.7%之間，RSD在2.05%-9.98%之間。
表1 44種蔬菜中17種酚酸的組成和含量
表2 蔬菜中17種酚酸的線性回歸、LOD和回收率
2.44種蔬菜酚酸譜的研究
採用高效液相色譜-質譜聯用法測定了我國常見的44種蔬菜中17種主要酚酸的含量和組成（圖1），6大類蔬菜中17種酚酸的平均濃度順序如下：花（64.39μg/g 鮮凍重[FW]）>根（56.68μg/g fw）>葉（53.44μg/g fw）>莖（48.07μg/g fw）>豆類（20.83μg/g fw）>水果（16.92μg/g fw），此外酚酸蔬菜中的種類分布如圖2所示。葉菜（17種）、根菜（17種）、莖菜（17種）的酚酸含量均高於豆類（3-10種）、水果（12-13種）、花卉（9-10種）。結果還表明，酚酸在不同蔬菜品種中的分布變化。芸苔科、百合科、菊科、葫蘆科和茄科蔬菜中檢測到的酚酸有10種以上，豆科蔬菜中檢測到的酚酸有4-10種。不同種類蔬菜的酚酸濃度和比例有差異，同一蔬菜不同組織中酚酸含量存在顯著差異。
圖1 44種蔬菜中17種酚酸的組成和濃度
對主要酚酸進行了定量分析。阿魏酸和芥子酸（44種蔬菜中檢出）、沒食子酸（43種蔬菜中檢出）、咖啡酸（41種蔬菜中檢出）和對羥基苯甲酸（40種蔬菜中檢出）在蔬菜中廣泛存在。僅在24種蔬菜中檢測到3,5-二羥基苯甲酸、2-羥基肉桂酸和3-羥基肉桂。聚類分析表明，阿魏酸（101.99-884.68μg/g乾重[DW]）、異芥酸（24.81-660.41μg/g DW）和p257香豆酸（9.27-67.41μg/g DW）的含量高於其它酚酸，並且主要存在於葉菜類蔬菜中。
咖啡酸由於其芳香環上的3,4-二羥基化作用而具有比對香豆酸更高的抗氧化活性。在目前的研究中，咖啡酸和對香豆酸在這些蔬菜中被廣泛檢測到。本研究發現，萵苣中咖啡酸含量最高（77.91 μg/g DW）。紫甘藍中對香豆酸含量最高（671.41μg/g DW）。甘蔗莖中阿魏酸含量極高，為（660.41μg/g DW），比排名最低的蔬菜南瓜 (2.79 μg/g DW)約高237倍，在蔬菜樣品中，綠蘿蔔的異芥酸（884.68μg/g DW）和紫甘藍（609.96μg/gdw）的芥酸含量最高。結果表明，蘿蔔、紫甘藍、萵苣等蔬菜可能是酚酸的良好來源。不同種類蔬菜中各種營養素和抗氧化劑的含量差異很大，導致不同蔬菜的抗氧化能力不同。同時，同一種類的不同蔬菜可能表現出不同的抗氧化活性。
3.44種蔬菜中游離酚酸和結合酚酸的分布
酚酸對蔬菜品質和人體健康的影響不僅取決於酚酸的種類和數量，而且還取決於底物中存在的形式。圖2顯示了44種蔬菜中的游離（游離和游離酯）和結合酚酸的分布。紫甘藍可溶性酚酸含量最高（121.42μg/g FW），蓮藕最低（0.82μg/g FW）。紫甘藍中不溶性酚酸含量最高（31.31μg/g FW），冬瓜最低（0.01μg/g FW）。6組蔬菜中含量差異有顯著性（P<0.001）。除莖類蔬菜（P<0.027）外，游離可溶性酚酸在蔬菜中佔優勢（P<0.1）。水果（P<0.020）、豆類（P<0.001）和葉菜類（P<0.001）中幾乎所有的酚酸都是少量結合的不溶性酚酸的基礎上自由溶解的結合酚酸，在細胞壁中起著重要的作用，它提供物理和化學屏障，防止病原體入侵，收斂，阻止昆蟲、動物、細菌和真菌的攻擊；此外，結合酚酸還具有抗氧化功能。不溶性結合酚酸在消化後能在胃腸中存活，並能到達結腸，這是由於細胞壁纖維材料的消化率較低，紫甘藍中總酚（152.73μg/g FW）和結合酚酸（77.36307μg/g FW）含量最高，這些值高於先前報告的值。這種差異可能是由於使用的檢測方法。然而，在深色蔬菜（紫甘藍和西蘭花）中發現的酚酸的濃度明顯高於其他蔬菜中；因此，深色蔬菜比淺色蔬菜表現出更強的抗氧化能力。酚酸之間沒有協同作用，使用含2，2'-疊氮雙（3-乙基苯並噻唑啉）的總抗氧化能力測定試劑盒僅觀察到添加作用。
圖2 （a) 濃度和 (b)6種蔬菜中游離和結合酚的比較。
4. 羥基苯甲酸和羥基肉桂酸在44種蔬菜中的分布
根據側鏈酚環上的碳原子數，我們可以將酚酸分為C6-C3和C6-C1化合物，它們分別來自羥基肉桂酸和羥基苯甲酸，儘管具有相同的基本骨架，酚酸類芳香環上羥基的數目和位置是不同的。不同蔬菜含有羥基肉桂酸和羥基苯甲酸（圖3），羥基肉桂酸由苯丙氨酸生物合成，是植物中分布最廣的酚酸。17種酚酸中，羥基肉桂酸8種，羥基苯甲酸9種，試驗蔬菜中羥基肉桂酸和羥基苯甲酸的含量分別為0.66-149.87和0.35-54.31μg/g FW。除胡蘿蔔、豆芽和花椰菜外，大多數蔬菜中羥基肉桂酸的含量均高於羥基苯甲酸（P <0.001）。紫甘藍中羥基肉桂酸含量最高，約為最蔬菜冬瓜的230倍。豆芽中羥基苯甲酸的含量最高，比排名最低的蔬菜雪豆高出約160倍。蔬菜中羥基肉桂酸和羥基苯甲酸的總濃度存在一定的差異。
圖3。（a）濃度和（b） 6種蔬菜中羥基肉桂酸和19-羥基苯甲酸的比較
本文建立了一種靈敏可靠的高效液相色譜-質譜聯用技術，用於蔬菜基質中17種酚酸的快速定性和定量分析。檢出限為0.008mg/L～0.042mg/L，平均回收率為71.0%～110.7%，RSD≤9.98%。該方法的靈敏度比以往報導的方法高，採用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）法測定了我國常見蔬菜中17種酚酸的含量。六種蔬菜中總酚酸的平均濃度順序如下：花（64.39μg/g FW）>根（56.68μg/g FW）>葉（53.44μg/g FW）>莖（48.07μg/g FW）>豆（20.83μg/g FW）>果（16.92μg/g FW）。酚酸在葉菜類（17種）、根類（17種）、莖類（17種）蔬菜中的分布比在豆類（3-10種）、水果（12-13種）和花（9-10種）中的分布更為豐富，在芸苔科、百合科、菊科、葫蘆科、茄科蔬菜中檢測到10多種酚酸，而在豆科蔬菜中僅檢測到4-10種酚酸。阿魏酸和芥子酸（44種蔬菜中檢出）、沒食子酸（43種蔬菜中檢出）、咖啡酸（41種蔬菜中檢出）、對羥基苯甲酸（40種蔬菜中檢出）。阿魏酸（101.99-884.68dw）、異芥酸393（24.81-660.41μg/g DW）和對香豆酸（9.27-67.41μg/g DW）的含量均高於其他酚酸，主要存在於葉菜類蔬菜中。除莖類蔬菜（P<0.027）外，其餘蔬菜均以游離酚酸為主（P<0.001）。水果（P<0.100）、豆類（P<0.001）和葉菜類（P<0.001）中幾乎所有酚酸都是游離的。在所有的樣本中羥基肉桂酸濃度為0.66-149.87μg/g，羥基苯甲酸總濃度為0.35-54.31μg/g。除胡蘿蔔、豆芽和花椰菜外，大多數蔬菜中羥基肉桂酸的含量比羥基苯甲酸高（P<0.001）。
花、葉和根類蔬菜富含天然抗氧化劑，酚酸濃度與蔬菜的總抗氧化能力有關。因此，蔬菜可作為預防氧化應激所致疾病的重要膳食來源。這項研究的結果有望為膳食指南和流行病學研究提供有力的支持。進一步研究這些蔬菜中酚酸的代謝和生物利用度是有必要的。
原文網址：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.10.074
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