研究思路|高通量qPCR晶片檢測案例解讀(第四期)

2020-12-13 美格基因

今天繼續給大家分享一篇高通量qPCR晶片檢測服務的應用文章，研究通過高通量qPCR晶片檢測技術對人類致病病原體和糞便汙染物來源進行檢測和定量，原文於2020年7月在Environmental Research上在線發表。

High-throughput diagnosis of human pathogens and fecal contamination in marine recreational water

海灘浴場循環水中人類病原體和糞便汙染溯源的高通量檢測方案

作者：Xin-Li An 等

期刊：Environmental Research

時間：2020.07.26

影響因子：5.715

一、文章摘要

細菌、病毒和真菌等致病病原體通過水體傳播和糞口傳播容易引起大範圍的人類疾病爆發，對世界公共衛生造成威脅，因此對病原體的檢測和汙染源的識別對於預防感染和疾病爆發至關重要。高靈敏度和高特異性的病原體檢測診斷工具的開發難點在於同時對多種病原體進行高效識別和量化，但目前已有的傳統技術耗時耗力，難以達到要求。

在本研究中，作者開發並在海灘浴場循環水中驗證了高靈敏度和高特異性的高通量qPCR檢測診斷方法。該方法可同時檢測33個人類病原體的68個標記基因，並且檢測10個宿主的23個糞便標記基因達到微生物溯源（MST）的目的。而實驗結果表明在海灘浴場循環水中檢測到7個致病病原體的標記基因，並發現了人和狗的糞便標記基因，說明高通量qPCR檢測診斷方法能快速檢測和量化病原體的汙染情況，為評估病原體風險和開發建立保護管理措施提供有力的數據。

二、主要內容

1.用於高通量qPCR方法的病原體和MST標記基因的優化

在廈門的13個海洋浴場中取了共39個樣本，檢測了水溫、pH和鹽度等理化性質，發現其中的差異不顯著。針對病原體標記基因的引物進行優化實驗，最終確定了33種病原體的68個標記基因，包括24個胃腸道疾病和9種肺炎或角膜炎相關的病原體。為了得到更加準確的定量信息，針對68個病原體標記基因均構建了標準質粒並進行qPCR反應，利用檢測得到的CT值構建標準曲線供後續樣本數據計算絕對定量時使用。而針對MST標記基因進行優化，最終確認10個宿主的23個糞便標記基因，檢測特異性均高於99%（圖1）。

圖1.宿主糞便標記基因豐度熱圖

2.海灘浴場循環水中的病原微生物

在9個海灘浴場循環水中共檢出了7種病原體，包括軍團菌屬（Legionella spp.）、致病性大腸桿菌（enteropathogenic E. coli）和棘阿米巴屬（Acanthamoeba spp.）等，豐度在1.4×103-1.1×105copies/L之間（圖2），其中軍團菌屬（Legionella spp.）標記基因陽性率超過61.5%，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）陽性率為23.1%。以上7種病原體在GZH地點都被檢測到，而在ZZW位點檢測到3種病原體。

作者採用了全長16S rRNA擴增子來深入研究樣本中微生物群落組成和分布與病原體的關係，物種注釋結果顯示變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）是各樣本中的主要組成部分，在各樣本中所佔的豐度達到93.7%-98.1%。進一步分析發現各樣本的α多樣性無顯著差異，而RDA分析表明環境因子共解釋22.9%的變異。經過篩選發現28個潛在人類病原體在各樣本中被檢測到，大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌是其中的主要致病病原體，與高通量qPCR的檢測結果一致。

圖2.基於高通量qPCR晶片的人類致病病原體豐度熱圖

3.海灘浴場循環水中的MST

糞便汙染是人類致病病原體傳播的主要途徑之一，基於高通量qPCR的方法可以檢測糞便來源標記基因，從而達到追蹤糞便汙染來源的目的。在本研究中，共有4個MST人和狗的糞便標記基因被檢測到，其中人糞便標記基因在所有樣本（除了MH）中均被檢出（表1）。

表1.基於高通量qPCR檢測方法的糞便溯源標記基因檢測情況統計

三、文章總結

本研究成功建立了高精確度、高靈敏度和高通量的qPCR檢測方法，可對人類致病病原體和糞便汙染物來源進行檢測和定量，實現實時監測和助於制定有效的管理措施。該方法已經成功運用在水域的病原體汙染監測，未來也可應用在其他環境樣本如土壤和空氣樣本中對病原體汙染進行監測。

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