點評 | 左二偉（中國農科院農業基因組研究所）、楊輝（中科院神經所）
責編 | 兮
新型基因編輯器A＆C-BEmax就像是哪吒，他可以用混天綾找到固定突變位點，用火尖槍糾正突變鹼基，馴服突變基因，使其改邪歸正，造福蒼生。Credit：李大力課題組
據 ClinVar 數據顯示，人類約58%的遺傳疾病是由於鹼基突變引起的【1】。CRISPR/Cas9技術可實現精確的鹼基修復，但其效率低下（0.1%-5%），且存在非靶向切割，高度精確修復能力的極大地限制了廣泛的的應用。
鹼基編輯系統(base editing)依據nickase Cas9（D10A）融合了不同的鹼基修飾酶分為胞嘧啶鹼基編輯器(cytosine base editors, CBE)和腺嘌呤鹼基編輯器(adenine base editors, ABE)。
這兩種鹼基編輯器能在不產生DNA雙鏈斷裂的情況下，在4-8(距離PAM遠端起)窗口內分別實現精準的CG到TA或AT到GC 的替換,高效、精準和低脫靶的特性使其逐漸成為基因編輯領域的新寵【2,3】。在疾病模型製作、精準基因治療、動植物遺傳育種，耐藥性篩選等領域展現出光明的發展前景【4,5】。
然而，現有的鹼基編輯器只能催化單一類型鹼基的轉換，這限制了其廣泛應用。因此，開發新的鹼基編輯器能高效地同時產生兩種不同鹼基的突變，這既是概念上的創新，也將極大地豐富鹼基編輯工具，在基因治療，物種改良和分子進化等方面都有重要意義。
2020年6月1日，華東師範大學李大力課題組在Nature Biotechnology雜誌發表了題為「Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells」的研究論文。
該研究將人類胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A突變體）融合在一起，開發了一種新型雙功能高活性鹼基編輯器-A&C-BEmax，它可以在同一等位基因的靶序列上實現C>T和A>G的高效轉換。與CBE和ABE相比，A&C-BEmax拓寬了C>T的編輯窗口，提高了編輯效率；A>G的窗口保持不變，效率略有下降,RNA脫靶水平大幅降低。
2018年David Liu實驗室開發出ABE7.10鹼基編輯器後，李大力課題組通過融合識別不同PAM的Cas9變體，大幅提高了ABE在小鼠和大鼠胚胎中的編輯效率的同時大大地拓寬了可編輯的靶點範圍【6】（Protein Cell, 2018）。
然而，無論是ABE還是CBE都只能催化單一鹼基的轉換，在研究ABE的同時，研究團隊猜測如果將兩種脫氨酶融合到Cas9n，是否能實現兩種鹼基高效的轉換呢？因此，通過將胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶在Cas9n兩端融合，構建了五種載體，通過哺乳動物細胞測試，發現將胞嘧啶脫氨酶hAID融合到ABE7.10的N端，展現出A/C同時轉換的特性，但此時效率偏低。
為了進一步提高效率，課題組通過密碼子、核定位信號、linker序列以及UGI串聯等多輪優化獲得了一種高效的A/C同時轉換的編輯器，並命名為：A＆C-BEmax（圖1）。經過上述系列優化，與原始構建體相比，A＆C-BEmax的鹼基轉化效率，產物純度和A/C同時轉換活性顯著提高，C（胞嘧啶）的編輯窗口大幅拓寬，且更安全，RNA脫靶率更低。
圖1：A&C-BEmax模式圖及不同構建體
為了公正地評價A＆C-BEmax的性能，科研人員在HEK293T細胞中測試了28個內源性靶點（其中4個靶點僅包含Cs或As）同時和與ABEmax和AID-BE4max進行對比。測試顯示， A＆C-BEmax的編輯窗口從C3-C10位擴展到了C2-C17位，在C7-C17位的編輯活性相對於AID-BE4max提高了1.9-14倍，而A>G的編輯效率與ABEmax相似或略有降低，但比ABEmax在RNA上的脫靶率更低，同一等位基因的A和C同時突變效率最高達到30％。（圖2）
圖2：A＆C-BEmax的工作特性
那麼這麼好的工具有什麼獨特的用途呢？論文進一步驗證了A＆C-BEmax在基因治療中的應用（圖2），將A＆C-BEmax遞送到紅細胞前體細胞中(HUDEP-2)。
結果表明，A＆C-BEmax能高效地破壞胎兒期血紅蛋白基因HBG1/2啟動子區域轉錄抑制因子BCL11A結合位點（-114C>T或-115C>T）並同時創建新的轉錄激活因子GATA1的結合位點（-113A>G），與周圍單獨產生C的編輯細胞相比，分化的HUDEP-2細胞中更高的HBG表達水平。（圖3）該工作展示了A&C-BEmax這一新型雙鹼基編輯系統對於精準治療β-血紅蛋白病的巨大潛力。
圖3：A＆C-BEmax在HUDEP-2細胞中高效激活HBG表達
最後，與楊力課題組合作，通過大數據挖掘，在ClinVar【6】和dbSNP【7】(SNPs)臨床資料庫中發現了臨床中A＆C-BEmax可同時靶向AC糾正203個臨床報導的致病突變；進一步拓展PAM為NG時， Cas9-靶向範圍增加了2.8倍（573個）。
研究團隊還統計到，A&C-BEmax與ABE或CBE相比，能實現60個額外的密碼子更改(18個胺基酸替換)，這些更改無法使用現有的單鹼基編輯器做到。
與單脫氨酶鹼基編輯器相比，A＆C-BEmax能高效地同時引入A>G和C>T編輯，因此產生的突變組合多樣性更大，且更安全。因此，這種擴展的編輯器將廣泛用於許多不同的研究和應用。A＆C-BEmax是成為分子記錄系統(例如譜系追蹤)以及飽和誘變篩選、定向進化強而有力的工具。
非常有趣的是，同一天Nature Biotechnology還在線發表了另外兩個在哺乳動物細胞中開發雙鹼基編輯器的工作，分別來自日本東京大學Nozomu Yachie實驗室以及美國麻省總醫院Keith Joung實驗室。
Nozomu Yachie實驗室將來源於七鰓鰻的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1和鼠源的胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1分別和腺苷脫氨酶(TadA)融合到nCas9（D10A）的C端和N端，開發了3種新的雙鹼基鹼基編輯器—Target-ACE/Target-ACEmax/ACBEmax。
他們通過該系統成功在哺乳動物細胞中實現了A/C的同時突變，平均編輯效率最高分別達C為50%和A為40%。大量實驗數據統計顯示，他們發現雙鹼基編輯器的特性和單個鹼基編輯工具的編輯效率，突變窗口和突變譜等特性相當， DNA和RNA脫靶，都在單種鹼基編輯器的範圍內。
Target-ACE與ABE+CBE共同作用相比，能更有效地在目標位點的序列窗口中同步高效地實現C>T和A>G點突變，且Target-ACE比單獨的CBE或ABE能誘導更多種類型的胺基酸轉換。最後他們使用深度測序數據對編輯模式進行建模，模擬了Target-ACE和其他單種鹼基編輯工具在整個人類基因組中的編輯譜，展現了Target-ACE能產生更多胺基酸突變種類，對於分子進化有重要意義。
而Keith Joung實驗室採用與日本科學家類似策略開發了一款雙鹼基編輯工具。與上述不同的是，他們採用了更短的腺苷脫氨酶(TadA)融合在N端，來源於七鰓鰻的胞嘧啶脫氨酶PmCDA1融合到催化受損的nCas9（D10A）C端的形式，開發了一款能同時編輯AC的新工具—SPACE（Synchronous programmable adenine and cytosine editor）。
該鹼基編輯器在保證C>T平均編輯效率和單個CBE效率相當，A>G平均編輯效率與單個ABE效率相比略有下降的前提下，在25個測試的靶點中有18靶點A和C同時突變的效率平均高於15%，22個靶點顯示，SPACE雙鹼基編輯效率明顯高於ABE+CBE的共同作用，經過統計新工具具有產物純度和切割效率和原單個系統比相當或更好的特性，與日本研究團隊的實驗結果一致。
2020年1月13日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞、李家洋老師合作在Nature Biotechnology雜誌在線發表的論文，將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ABE7.10同時融合在nCas9的N端，構建了4種形式的新型的飽和靶向內源基因突變鹼基編輯器STEME-1至STEME-4（saturated targeted endogenous mutagenesis editors），也可以實現只在一個sgRNA引導下就可以誘導靶位點C>T和A>G的同時突變，顯著增加了靶基因鹼基突變的飽和度及突變類型的多樣性。
STEME-1在水稻原生質體中C>T誘導效率高達61.61%，C>T和A>G同時突變的效率也高達15.50%。STEME技術體系的建立，對於原位（In situ）定向進化植物的內源功能基因提供了新型技術支撐，對農作物分子設計育種具有重要意義。
上述四個團隊以2種不同的構建策略，開發了類似功能的新型雙鹼基編輯器，都實現只有一個靶點的引導下就可以誘導靶位點C>T和A>G的同時突變。
李大力和高彩霞課題組經過不同的位置測試分別將胞嘧啶脫氨酶hAID與APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時融合在nCas9(D10A)的N端，分別證明了雙鹼基編輯器可有望應用於基因治療和作物改造。
兩個工作也幾乎同時投稿。同期發表的這兩個組的研究，雖然也具有AC同時突變的功能，但是李大力課題組開發的A&C-BEmax在動物細胞中表現出更高的CBE活性、更廣的編輯窗口以及更高的AC同時突變的效率，將更有潛力成為治療學和譜系追蹤、飽和突變篩選等生物技術強有力的工具。
值得注意的是，同樣是哺乳動物細胞，李大力課題組的工作展現了更高CBE活性和突變窗口以及A/C同時突變的效率，證明A&C-BEmax相比SPACE和Target-ACE具有更好的表現。
據悉，華東師大生命科學學院2016級博士研究生張曉輝，2017級博士研究生朱碧雲和2018級碩士研究生陳亮為該論文的共同第一作者，李大力教授為本文通訊作者，中國科學院上海生命科學研究院計算生物學研究所楊力研究員參與了部分研究工作。
專家點評
左二偉（中國農科院農業基因組研究所）、楊輝（中科院神經所）
雙劍合璧——雙鹼基基因編輯工具的開發與應用
單鹼基突變是人類的遺傳疾病主要致病原因之一。通過CRISPR/Cas9結合NHEJ或者HDR方式修復鹼基突變的方法，已經在動物模型上實現了治療人類遺傳疾病的目的。
但在CRISPR/Cas9介導的修複方法中，同時在大量細胞誘導產生的DNA雙鏈斷裂有可能導致基因組的異位、倒位、激活原癌基因（如p53）異常表達等潛在問題，並對基因組存在難以預測的損傷【8】。
為了消除這些不利因素，基因編輯大牛David liu與同事將失去催化活性的Cas9與脫氨酶融合，在sgRNA指導下，在不產生雙鏈斷裂的情況下實現單核苷酸的定向突變，建立了單鹼基基因編輯系統【9】。
較高安全性和高效性促使單鹼基編輯系統迅速應用於多種動物、植物以及人類基因組的編輯研究，並且逐漸與動物模型結合進行遺傳疾病研究與治療的探索，為多種遺傳性疾病的治療帶來了希望。
目前較為成熟的單鹼基基因編輯技術包括CBEs (C→T)與ABEs (A→G)兩種，都源自哈佛大學David R. Liu實驗室，在相關領域科學家的努力下，這兩種工具的鹼基編輯效率與精確性等也逐步得到了提高與改善【9】。
儘管這兩種單鹼基基因編輯技術具有廣泛的應用性，但想要同時對相鄰位置的兩個鹼基位點進行編輯的時候，這兩種單鹼基基因編輯技術的限制性便有所體現——同時或分步使用兩種單鹼基編輯工具進行基因編輯不但效率低，還可能帶來更多的脫靶效應，在可行性與安全性上都不理想。
近日，Nature Biotechnology(NBT) 雜誌連續推出4篇雙鹼基基因編輯技術的相關研究論文，其中兩篇分別由中科院遺傳發育所的高彩霞課題組與華東師範大學李大力課題組完成。
這4篇論文中開發的雙鹼基基因編輯工具具有相似的結構，能對臨近的CA鹼基同時進行CA→TG的鹼基替換，實現雙鹼基基因編輯，且該工具有較好的安全性，對人類遺傳疾病的治療及動植物基因編輯、遺傳育種等都具有較高的應用價值。
這四篇論文的連續發表充分表明了鹼基基因編輯技術是目前基因編輯領域的熱點，也說明了鹼基編輯工具在未來將得到更進一步發展與完善，並更好地為科研與臨床應用服務。接下來我們對這四篇文章分別進行梳理與解讀，以供讀者探討。
在同時上線的4篇文章中，哈佛醫學院J. Keith Joung課題組的設計較為簡單也易理解。他們將傳統的CBEs工具與ABE工具相結合，在nCas9的N端保留AID（A→G的主要功能元件），並將rAPO1（C→T的主要功能元件）與UGI整合到nCas9的C端，設計出名為SPACE（synchronous programmable adenine and cytosine editor (SPACE)）的雙鹼基基因編輯工具，並成功在HEK293T細胞上實現了雙鹼基基因編輯，且在其後對這一工具DNA與RNA的脫靶性（off-target）進行了相關檢測。
而東京大學的Nozomu Yachie課題組則對有著類似結構的雙鹼基基因編輯工具著重進行了鹼基編輯活性以及編輯準確性方面的研究與探討。
在進行雙鹼基基因編輯工具的構建過程中，Nozomu Yachie等對rAPO1與AID蛋白質元件所在的空間位置及其對應的相關性能進行了較為詳細的研究與探討，並最終提出了N端為AID而C端為rAPO1元件的ACBEmax雙鹼基基因編輯工具，且對ACBEmax的脫靶性進行了驗證。該研究中也利用machine learning的方法嘗試對這一工具的編輯模式及效率進行相關預測，對ACBEmax基因編輯的高效性進行相關驗證。
華東師範大學李大力課題組也提出了相似的、但在空間結構上有所不同的雙鹼基基因編輯工具A&C-BEmax，並將這一工具在相關的細胞模型中進行了較好的應用。
李大力等在進行雙鹼基基因編輯工具的構建過程中也對rAPO1及TAD元件的空間位置及其對應的鹼基編輯性能進行了較為詳細的篩選與對比，最終確認了只有TAD元件整合在nCas9的N端時雙鹼基基因編輯工具才具有相關活性，並提出了rAPO-TadA-TadA-nCas9-UGI-UGI的鹼基基因編輯工具：A&C-BEmax。
文章中也對這一工具進行了初步的DNA與RNA脫靶的研究，並將這一工具在HUDEP-2細胞模型中加以應用，通過對HBG啟動子區域的雙鹼基基因編輯成功地將γ-globin的mRNA表達水平提高了45.9%-73.7%。A&C-BEmax在HUDEP-2細胞上的應用也提示了雙鹼基基因編輯工具在人的遺傳性血液疾病臨床治療中的良好應用前景。
中科院遺傳發育所的高彩霞課題組也同時提出了與以上幾篇文章研究類似的雙鹼基基因編輯工具STEMEs（saturated targeted endogenous mutagenesis editors），並將這一工具在植物的鹼基編輯中進行了良好的應用。
STEMEs鹼基編輯工具的結構與李大力課題組報導的工具類似，在N端整合了APO3A元件與TAD元件，並最終提出了APOBEC3A-ecTadA-ecTadA7.10-nCas9-NLS-UGI-NLS的構件。同時，研究中也將nCas9-NG（D10A）替換原有的nCas9元件，擴大了這一雙鹼基基因編輯工具在植物中的打靶能力與應用範圍。
最後，STEME-NG也被成功用於OsACC CT區域的鹼基編輯從而構建抗除草劑突變體的水稻植株，說明了這一雙鹼基基因編輯工具在植物抗病遺傳育種中的良好應用前景。
以上四篇研究具有一定的相似性，都利用了單鹼基基因編輯工具CBEs與ABEs中的相關元件重新設計整合，構建成了同時能進行兩個鄰近鹼基CA→TG置換的雙鹼基基因編輯工具。
然而，在這些研究中仍然存在需要繼續優化與完善的地方。經典的CBEs與ABEs工具在單獨使用時具有5-6nt左右較窄的鹼基編輯窗口（window）【9,10】，而整合形成的雙鹼基基因編輯工具的鹼基編輯窗口在李大力等的報導中則C→T與A→G的窗口分別擴增到了16與13個核苷酸，在其他幾篇文章中也有類似的現象。
雖然這些特性在擴展雙鹼基基因編輯能力時具有一定的意義，但從另一方面而言，編輯窗口的擴張代表著鹼基基因編輯工具在進行單鹼基基因編輯時精確性與特異性的降低，也暗示著在打靶位點約20bp的片段內容易出現不符合預期的突變情況。然而有意思的是，編輯窗口以及可編輯鹼基類型的增加，或許更適合用作為高通量篩選工具【12,13】。
同時，在這四篇報導中，雙鹼基基因編輯工具的安全性仍需要進一步地驗證與評估。雖然雙鹼基基因編輯工具CBEs工具相比具有較低的脫靶效應，但這些脫靶效應不可忽視，它們仍然是限制雙鹼基基因編輯工具在生命科學研究與臨床應用中的重要因素。因此，利用具備更低脫靶效果的APOBEC/TAD變體重新整合雙鹼基基因編輯工具可能是提高該工具安全性的有效方法之一。
儘管雙鹼基基因編輯工具仍需要進一步的研究與完善，但它的出現仍然為人們提供了更為方便有效的基因編輯策略，增進了我們對鹼基基因編輯工具的認識與理解。同時，在這四篇報導中對雙鹼基基因編輯工具的相關應用暗示了我們這一工具在動物、植物多物種中的可用性，並說明了該工具在基礎研究與醫學研究中廣闊的應用前景。
例如雙鹼基基因編輯工具在紅細胞細胞系HUDEP-2中的應用說明了這一工具在臨床治療中的潛力，而雙鹼基基因編輯工具在水稻中的應用則說明了這一工具在植物抗病育種中的重要價值。這些研究為基因編輯工具的發展方向及其在各領域中的廣泛應用提供了很好的參考，並為我們更進一步地開發與利用鹼基基因編輯工具提供了新的思路。
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